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引起老齡貓牙齦炎細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定

2016-09-20 03:50葉妍琳趙振江楊子江
中獸醫(yī)學(xué)雜志 2016年4期
關(guān)鍵詞:牙齦炎氏桿菌鏈球菌

葉妍琳,趙振江,楊子江,付 偲,楊 濤,肖 嘯、2*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,云南昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院,云南昆明650031)

引起老齡貓牙齦炎細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定

葉妍琳1,趙振江1,楊子江1,付偲1,楊濤1,肖嘯1、2*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,云南昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院,云南昆明650031)

∶牙齦炎是老齡貓發(fā)病機率較高的一種疾病,也是貓類健康危害較大的疾病之一,隨著伴侶寵物市場的不斷發(fā)展,老齡貓牙齦炎的病例也隨之增多,因此,對于引起老齡貓牙齦炎致病菌的研究也顯得尤為重要;通過采樣拭子采集患牙齦炎的牙齦分泌物樣本,分離到16株菌,通過菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生化特性,確定這16株細(xì)菌中有3種,分別是葡萄球菌、鏈球菌、陰性巴氏桿菌;引起老齡貓牙齦炎的致病菌是∶葡萄球菌、鏈球菌。

∶老齡貓牙齦炎;葡萄球菌;鏈球菌;分離培養(yǎng);鑒定

1 引言

牙齦炎為牙齦部分組織發(fā)生的炎癥,老齡貓牙齦發(fā)生時首先流涎最常見,最初有食欲,但咀嚼或吞咽出現(xiàn)障礙,進而食量逐漸減少,想吃但是不張嘴,逐漸消瘦,口臭明顯[1]。局部淋巴結(jié)腫大,牙齦除血。打開口腔發(fā)現(xiàn)牙齦、牙床、口腔黏膜等部位紅腫、潰瘍并且出血等。嚴(yán)重病例常伴有全身癥狀[2],如體溫升高、精神沉郁、廢食等。外觀癥狀上,貓咪會應(yīng)因為疼痛,而產(chǎn)生行為上的怪異,例如;易怒、具有攻擊性、抑郁、喜歡獨處、進食困難,不整理毛發(fā)(舔毛),當(dāng)然口臭是最常見的現(xiàn)象。是老齡貓發(fā)病機率較高的一種疾?。?]。也是貓類健康危害較大的疾病之一。

近年來,隨著伴侶寵物市場的不斷發(fā)展,老齡貓牙齦炎的病例也隨之增多[4]。貓的壽命較長,如果從小就能精心飼養(yǎng)管理,大多數(shù)的貓都能活14~17年(相當(dāng)于人70~80歲)。貓在8~9歲時,開始進入老年期[5],但它的衰老過程比較緩慢,衰老特征逐漸出現(xiàn),只要主人細(xì)心觀察就能發(fā)現(xiàn)。和人類一樣,寵物也面臨老齡化的問題,因此,對于引起老齡貓牙齦炎致病菌的研究也顯得尤為重要[6]。

引起老齡貓牙齦炎的病因有很多種,其一是,老齡貓本身體質(zhì)。抵抗力、免疫力就比較弱,細(xì)菌、真菌、病毒(貓杯狀病毒、貓鼻氣管炎病毒等)的侵入造成病變[7],而一部分病因很可能是由潛在的疾病引起的,特別是老齡貓,慢性腎功能衰竭、白細(xì)胞減少癥(下降的白血細(xì)胞數(shù)量)。另外,有極少數(shù)由糖尿病引致。雖然引起老齡貓牙齦炎的病因較多且復(fù)雜,但只要是細(xì)菌感染所致,如不配合采用抗生素治療,病情反復(fù)機率很大[8]。雖然,理論上有很多藥物能治療貓牙齦炎,但隨著抗菌藥物的廣泛使用以及臨床中不合理使用藥物,使得病原菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重,所以在日常飼養(yǎng)過程中應(yīng)多注意它的活動和行為,發(fā)現(xiàn)異常,不要給它亂服藥,應(yīng)及時送寵物醫(yī)院就診服藥一定要根據(jù)醫(yī)囑不要隨意改變。

2 材料與方法

2.1試驗時間、地點采集來自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院就診時出現(xiàn)牙齦炎癥狀的老齡貓的牙齦分泌物,裝予滅菌采樣管中冷藏。2015年3月3日至2016年4月14日在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院牧醫(yī)樓實驗室進行室內(nèi)試驗。

2.2試驗材料

2.2.1實驗病料采集到的三只患牙齦炎的老齡貓的牙齦分泌物。

2.2.2主要儀器設(shè)備顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、載玻片、蓋玻片、氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、酒精燈、立式壓力蒸汽滅菌器、冰箱、臺式高速離心機、接種環(huán)、染色缸、染色架等。

2.2.3培養(yǎng)基與試劑蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、乳糖、磷酸氫二鉀、膽鹽、普通肉湯培養(yǎng)液、血瓊脂平板培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、新型微生物微量生化鑒定管、革蘭氏染液等。

2.3試驗方法

2.3.1培養(yǎng)基(液)的制備參照參考文獻[9]配制

2.3.1.1普通肉湯的制備∶蛋白胨2g;牛肉膏1g;氯化鈉1g;加熱溶于200ml雙蒸水中,調(diào)節(jié)PH值為7.3-7.5,121℃高壓滅菌15min備用。

2.3.1.2普通瓊脂培養(yǎng)基的制備∶蛋白胨4g;牛肉浸粉1g;瓊脂2.6g;加熱溶于200ml雙水中,調(diào)節(jié)PH值為7.3-7.5,121℃高壓滅菌15min備用。

2.3.1.3血瓊脂平板培養(yǎng)基的制備∶牛肉膏3g;蛋白胨10g;Nacl5g;瓊脂15g;溶解于1000ml雙蒸水中,PH調(diào)節(jié)到7.4-7.6,121℃高壓滅菌15min備用。

2.3.2細(xì)菌的增菌在超凈工作臺上,用槍頭滴管把配好的肉湯培養(yǎng)液分別取適量裝入采好的病料高壓滅菌的試管中,并且標(biāo)明編號,然后置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)24小時。

2.3.3細(xì)菌的分離接種環(huán)將過夜培養(yǎng)的肉湯培養(yǎng)液在超凈工作臺上分別接種到血瓊脂平板培養(yǎng)基上,并且標(biāo)明接種的編號。接種時用接種環(huán)以“Z”字型畫開,每涂過培養(yǎng)皿的一半時旋轉(zhuǎn)90°,用接種環(huán)繼續(xù)沿“Z”字末端畫開。接種完成后將培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)18h-24h。

觀察菌落生長情況,長出圓形、中等大小、光滑、不透明、濕潤的菌落,有不太明顯的溶血環(huán);微小灰白色半透明菌落。

2.3.4細(xì)菌的純培養(yǎng)在超凈工作臺上挑取培養(yǎng)皿中挑取典型的單個無污染的菌落分別接種到普通肉湯培養(yǎng)基中,放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h-24h,增菌培養(yǎng),得到純化的菌落。

并對在普通肉湯培養(yǎng)基上,純化無污染的菌落進行革蘭氏染色、鏡檢,疑似葡萄球菌、鏈球菌。

2.3.5細(xì)菌革蘭氏染色、鏡檢

2.3.5.1制片取活躍生長期菌種按常規(guī)方法涂片(不易過厚),干燥和固定。

2.3.5.2初染滴加草酸銨結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位,染色1~2min后傾去染液,水洗至流出水無色。

2.3.5.3媒染用碘液覆蓋1min,傾去碘液,水洗至流出水無色。

2.3.5.4脫色將玻片上殘留水用吸水紙吸取,在白色背景下用滴管流加95%乙醇脫色(一般20~30s),當(dāng)流出液無色時立即用水洗去乙醇。

2.3.5.5復(fù)染將玻片上殘留水用吸水紙吸取,用番紅復(fù)染液染色2min,水洗,吸去殘水晾干。

2.3.5.6鏡檢把制作好的玻片放在顯微鏡上,低倍鏡找出細(xì)菌的范圍,然后在待檢部位上加一滴香柏油,轉(zhuǎn)動鏡頭轉(zhuǎn)換器,將油鏡頭置于工作位置,從側(cè)面觀察并緩慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器,使油鏡頭浸沒在油滴內(nèi),當(dāng)油鏡頭幾乎接觸玻片時停止轉(zhuǎn)動,然后眼睛移至目鏡,緩慢向上移動粗調(diào)節(jié)器(只應(yīng)上升,不能下降,以免壓碎標(biāo)本和損壞鏡頭),待看到模糊物象時,再用細(xì)調(diào)節(jié)器轉(zhuǎn)動至物象完全清晰為止。

2.3.6生化鑒定

2.3.6.1將純化所得的細(xì)菌接種于營養(yǎng)肉湯中,恒溫37℃培養(yǎng)18h-24h待用。

2.3.6.2細(xì)菌懸液的制取在無菌操作臺上分別吸取4ml經(jīng)過夜培養(yǎng)的肉湯菌液于經(jīng)高壓滅菌的離心管內(nèi),2000rmp離心20min,去上清液,加入1ml無菌生理鹽水混勻。

凝固酶試驗∶取肉湯培養(yǎng)物同凝固酶試驗兔血漿于試管內(nèi)充分混合,置37℃培養(yǎng),6h后觀察,如果內(nèi)容物完全凝固,為陽性,液體不凝固為陰性。

馬尿酸鈉水解試驗∶將細(xì)菌接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)48h后,離心吸取上清液,加入氯化高鐵立即混勻,10min后觀察結(jié)果,振蕩后沉淀物不消失為陽性,消失為陰性。

七葉苷水解試驗∶將細(xì)菌接種于七葉苷培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)48h后,觀察結(jié)果。如果培養(yǎng)基變成黑色者為陽性,不變?yōu)殛幮浴?/p>

甘露醇、山梨醇發(fā)酵試驗∶將細(xì)菌接種于對應(yīng)的培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)48h后,觀察結(jié)果如果培養(yǎng)基變成黃色者為陽性,不變?yōu)殛幮浴?/p>

3 結(jié)果與分析

通過對來云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院就診時出現(xiàn)牙齦炎癥狀的三只老齡貓的牙齦分泌物細(xì)菌的培養(yǎng)、分離、染色鏡檢、生化鑒定,最后確定的細(xì)菌分別是葡萄球菌、鏈球菌。下面對實驗結(jié)果進行分析∶3.1病原分離與培養(yǎng)在37℃培養(yǎng)的血平板上有溶血菌落、灰色圓形菌落和白色菌落(詳見平板1、2、3),將純培養(yǎng)的溶血菌落進行革蘭氏染色,發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性鏈球菌;將灰色圓形菌落進行染色,得到革蘭氏陰性巴氏桿菌;將金黃色的菌落革蘭氏染色,看到革蘭氏陽性球菌,呈球形或稍呈橢圓形,排列成葡萄狀。分離培養(yǎng)三份病貓樣品時,分離得到疑似葡萄球菌8株,疑似鏈球菌5株,疑似巴氏桿菌3株,故做了生化鑒定,把三種細(xì)菌分為A、B、C兩組討論,A代表疑似葡萄球菌;B代表疑似鏈球菌;C代表疑似巴氏桿菌。詳見圖1、圖2、圖3.

血平板1 

血平板2

血平板3

3.2生化試驗

3.2.1分離菌A生化試驗

表1結(jié)果表明,試驗菌株與判斷標(biāo)準(zhǔn)相符,A菌為葡萄球菌;9],共分離得到8株.

圖1 疑似葡萄球菌 

圖2 疑似鏈球菌

圖3 疑似巴氏桿菌

表1 A菌生化鑒定結(jié)果

3.2.2分離菌B生化試驗表2結(jié)果表明,試驗菌株與判斷標(biāo)準(zhǔn)相符,B菌為鏈球菌[10],共分離得到5株。

表2 B細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

3.2.3分離菌C生化試驗∶與判斷標(biāo)準(zhǔn)比較后,試驗菌株與判斷標(biāo)準(zhǔn)相符,因此C菌為陰性巴氏桿菌[11],共分離得到3株,見表3.

表3 C細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

與判斷標(biāo)準(zhǔn)比較后,實驗所分離培養(yǎng)到的菌株與葡萄球菌、鏈球菌、巴氏桿菌判斷標(biāo)準(zhǔn)相符。結(jié)合細(xì)菌菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢的結(jié)果,最后確定所分離到的菌為葡萄球菌、鏈球菌和陰性巴氏桿菌。

4 討論

4.1引起老齡貓牙齦炎的病因有很多,在這里只是研究臨床上最常見的細(xì)菌型,采樣過程中發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長貓患口腔炎的機率也大大增加,這可能是由于一些齒垢的積累損傷口腔黏膜,口腔免疫力下降,致使大量繁殖所引起,最終導(dǎo)致牙齦炎。不過齒炎口炎的發(fā)展過程,看法倒是較一致的,就是∶不當(dāng)?shù)胤窖装Y反應(yīng)。牙齦組織對牙斑(細(xì)菌和口水、食物的共同產(chǎn)物)產(chǎn)生不耐導(dǎo)致發(fā)炎。臨床上觀察到的牙齦口炎,一開始就發(fā)生在牙齒與牙齦之間,外觀上可以看到紅腫的患部。而細(xì)菌性牙斑如果繼續(xù)與細(xì)菌交互作用,則會繼續(xù)發(fā)展成牙結(jié)石,到了有結(jié)石階段時,牙齒結(jié)構(gòu)將受到破壞。

目前在牙齦口炎治療上,倒是有一種較激進的處理方式,就是全口拔牙。貓咪齒齦和牙齒之間,如同水火,誓不兩立,所以有些獸醫(yī)會建議飼主,當(dāng)貓咪發(fā)現(xiàn)有牙齦炎(牙齒和牙齦之間泛紅)時,就做全口拔牙的動作,免得日后發(fā)生嚴(yán)重的口齦炎,這一點,我倒是采保留看法,理由∶拔牙不是輕松的工作!牙齦還很健康的貓,牙根也很健全,如果要拔牙,得做整套。切牙韌帶會造成出血,用拔牙艇松動牙齒還是出血,加上貓嘴小、貓牙更小,拔牙艇不好操作。用拔牙鉗拔出,又是出血、往往還沒在拔牙鉗上使力時,牙齒就應(yīng)聲斷裂,殘留的牙根又是一個禍根,高速電鉆打磨也是出血。貓牙體積小是讓貓咪拔牙難度升高的主因。

所以,對于貓的口腔問題,建議多在洗牙和口腔衛(wèi)生上下手,口腔狀況較差的貓,提醒飼主回診的時間,定期的檢查與清潔,必要時會拔除已經(jīng)發(fā)炎較嚴(yán)重的牙齒,此時牙齒已經(jīng)較好拔除,發(fā)炎的組織在拔牙后一個月內(nèi),也會得到很好的響應(yīng)。當(dāng)然,并不是每只貓,都可以在較優(yōu)勢的時間點,被發(fā)現(xiàn)牙齦有異狀,所以有時候,當(dāng)貓咪被送到診所時,可能已經(jīng)整個牙齦都紅腫潰爛,有的案例甚至侵犯到較深的咽喉部,貓咪的痛苦可想而知。

4.2采樣是在夏季,明顯看得出的致病菌是葡萄球菌和鏈球菌,巴氏桿菌是陰性菌??赡懿煌募竟?jié)引起貓牙齦炎的致病菌有所不同。

5 結(jié)論

從患有牙齦炎癥狀的三只老齡貓的牙齦分泌物中分離出16株細(xì)菌中,通過菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生化特性,確定這16株細(xì)菌中有3種,分別是葡萄球菌、鏈球菌和巴氏桿菌。引起老齡貓牙齦炎的是具有一定致病力的葡萄球菌和鏈球菌。

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S858.292

B

1003-8655(2016)04-0010-04

2016-04-20

∶葉妍琳(1990-),女,云南昆明人,臨床獸醫(yī)碩士研究生,研究方向為獸醫(yī)臨床診斷學(xué)。

∶肖嘯(1966-),云南昆明人,執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師,云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院教授,研究生導(dǎo)師,云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院院長,研究方向為動物病理學(xué)和經(jīng)濟性動物寄生蟲研究;小動物疾病學(xué)及重大動物疫病防控技術(shù)。

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