張媛，李建，李偉杰，魏財(cái)文，蔣玉文

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

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PCR檢測(cè)方法在多殺性巴氏桿菌定種中的應(yīng)用

張媛，李建，李偉杰，魏財(cái)文，蔣玉文*

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為修訂行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)》(NY/T 564-2002)，改進(jìn)多殺性巴氏桿菌定種方法，采用16S rDNA基因序列分析法對(duì)中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)保藏的63株豬源多殺性巴氏桿菌進(jìn)行復(fù)核鑒定。63株豬源多殺性巴氏桿菌中有60株菌種與原鑒定結(jié)果一致。建立多殺性巴氏桿菌基于kmtΙ基因的PCR定種方法，對(duì)經(jīng)16S rDNA PCR方法確認(rèn)為多殺性巴氏桿菌的60株菌進(jìn)行定種。結(jié)果表明，60株菌均擴(kuò)增出了預(yù)期片段，基于kmtΙ基因的PCR定種方法與16S rDNA PCR方法試驗(yàn)結(jié)果相一致。研究結(jié)果顯示，可將基于kmtΙ基因的PCR定種方法增添至行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，作為原有生化鑒定方法的補(bǔ)充進(jìn)行多殺性巴氏桿菌的定種。

多殺性巴氏桿菌；16S rDNA基因；kmtΙ基因；序列分析

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)》(NY/T 564-2002)[1]于2002年予以實(shí)施，其中病原鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)等均通過(guò)菌株表型特征予以確定，廣大獸醫(yī)工作者參照此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行豬巴氏桿菌病的診斷[2-5]。但十余年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅猛，許多新的分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)在巴氏桿菌病診斷中得以應(yīng)用[6-8]，這些新技術(shù)相比傳統(tǒng)診斷技術(shù)更加快速便捷。為此，本課題組承擔(dān)了《豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)》(NY/T 564-2002)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的修訂工作，擬以中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)保藏的豬源多殺性巴氏桿菌為研究對(duì)象，對(duì)多殺性巴氏桿菌定種方法開展研究。為了確保研究對(duì)象的準(zhǔn)確性，本課題組采用16S rDNA基因序列分析法對(duì)CVCC保藏的63株豬源多殺性巴氏桿菌進(jìn)行復(fù)核鑒定。鑒定結(jié)果表明，63株豬源多殺性巴氏桿菌中有60株菌種與原鑒定結(jié)果一致，可用于《豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)》修訂的研究工作。本課題組建立了基于kmtΙ基因的PCR定種方法，對(duì)經(jīng)16S rDNA PCR方法確認(rèn)為多殺性巴氏桿菌的60株菌進(jìn)行定種，并將此結(jié)果與16S rDNA PCR結(jié)果相比，兩種方法的定種結(jié)果完全吻合。這一結(jié)果為把基于kmtΙ基因的PCR定種方法增添至行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 實(shí)驗(yàn)所用菌株為63株，均為CVCC保藏[9]。各菌株相關(guān)信息如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株Tab 1 Strains in the test

續(xù)表

1.2 培養(yǎng)基及試劑 馬丁肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自北京中海動(dòng)物保健科技公司。TaqDNA聚合酶、10×PCR緩沖液、dNTP、DL2000 DNA Marker和瓊脂糖均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。染料Goldview購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。PCR陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細(xì)菌制品檢測(cè)室制備。

1.3 PCR引物 16S rDNA基因序列擴(kuò)增引物：上游引物為5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物為5′-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3′(表2)。kmtΙ基因序列擴(kuò)增引物：上游引物為5′- ATC CGC TAT TTA CCC AGT GG -3′，下游引物為5′- GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC -3′(表2)。引物均由上海Invitrogen公司合成。

表2 多殺性巴氏桿菌基因擴(kuò)增用引物Tab 2 Primers for amplifying P. multocida genes

1.4 菌體培養(yǎng) 開啟菌種，用含0.1%綿羊裂解血細(xì)胞全血及4%新生牛血清的馬丁肉湯溶解菌種，劃線接種含0.1%綿羊裂解血細(xì)胞全血及4%新生牛血清的改良馬丁瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種含0.1%綿羊裂解血細(xì)胞全血及4%新生牛血清的馬丁肉湯，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)15 h。

1.5 基因組DNA提取 取1 mL菌液12000 r/min離心1 min，盡棄上清，加入100 μL超純水，混勻，沸水浴10 min，冰浴5 min，12000 r/min離心1 min，吸取上清作為16S rDNA PCR及基于kmtΙ基因PCR的模板。

1.6 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè) 16S rDNA PCR反應(yīng)體系為50 μL，依次加入超純水36.75 μL，10×PCR緩沖液(含MgCl215 mmol/L及KCl 500 μmol/L) 5 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.25 μL，模板2 μL?；趉mtΙ基因PCR反應(yīng)體系亦為50 μL，依次加入超純水36.75 μL，10×PCR緩沖液(含MgCl215 mmol/L及KCl 500 μmol/L) 5 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.25 μL，模板2 μL。PCR反應(yīng)條件均為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取10 μL 16S rDNA PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，140 V電泳30 min。顯色劑為Goldview。

1.7 序列測(cè)定及分析 取16S rDNA PCR產(chǎn)物送交上海基康生物工程有限公司測(cè)序。取測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，根據(jù)峰值圖修正重疊序列中幾次測(cè)序結(jié)果不一致位置的核苷酸，選擇測(cè)序峰較好區(qū)域的序列與GenBank上的DNA序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳條帶1505 bp，部分菌株的16S rDNA基因擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1?；趉mtΙ基因PCR產(chǎn)物電泳條帶457 bp，部分菌株的基于kmtΙ基因擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2 16S rDNA序列比對(duì)分析結(jié)果 經(jīng)核酸序列比對(duì)確定63株菌中有60株為多殺性巴氏桿菌，60株多殺性巴氏桿菌與GenBank公布的多殺性巴氏桿菌對(duì)應(yīng)DNA序列的同源性均大于97%，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 基于kmtΙ基因PCR定種結(jié)果 用多殺性巴氏桿菌基于kmtΙ基因種特異性PCR方法對(duì)經(jīng)16S rDNA PCR方法確定為多殺性巴氏桿菌的60株菌進(jìn)行種鑒定，符合率100%。

3 討 論

原核生物的核糖體是由50S和30S兩個(gè)亞基所組成，而30S亞基進(jìn)一步由3種類型組成，即23S、16S和5S，它們分別含有約2900、1500和120個(gè)編碼核苷酸[10]。目前由于分子量適中，又具有保守性和存在的普遍性等特點(diǎn)，一般采用16S rDNA對(duì)微生物進(jìn)行測(cè)序分析。

一般來(lái)講，在種分類等級(jí)上，如果2個(gè)分類單位間的16S rDNA序列同源性大于97%，則認(rèn)為屬于同一個(gè)種[11]。本課題組以多殺性巴氏桿菌16S rDNA的一段保守區(qū)序列設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物，對(duì)CVCC保藏的63株多殺性巴氏桿菌的一段16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列與GenBank上的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較，其中有60株菌與標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸序列的同源性都大于97%，可以確認(rèn)為多殺性巴氏桿菌。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：菌株CVCC1657；2： 菌株CVCC1658；3： 菌株CVCC1659；4：菌株CVCC1660；5：菌株CVCC1661；6：菌株CVCC1662；7：菌株CVCC1694；8：菌株CVCC1695；9：菌株CVCC1696；10：陰性對(duì)照：無(wú)菌超純水M: DNA marker; 1: CVCC1657 strain; 2: CVCC1658 strain;3: CVCC1659 strain; 4: CVCC1660 strain; 5:CVCC1661 strain; 6: CVCC1662 strain; 7: CVCC1694 strain; 8: CVCC1695 strain;9: CVCC1696 strain; 10: Negative control: sterile ultrapure water圖1 9株多殺性巴氏桿菌16S rDNA PCR產(chǎn)物的電泳圖Fig.1 Electrophoresis of 16S rDNA PCR products from 9 strains P. multocida

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：胸膜肺炎放線桿菌；2： 副豬嗜血桿菌；3：波氏桿菌；4：菌株CVCC1657；5：菌株CVCC1658；6：菌株CVCC1659M: DNA marker; 1: Actinobacillus pleuropneumoniae; 2: Haemophilus suis; 3: bordetella bacilli; 4: CVCC1657 strain; 5: CVCC1658 strain; 6: CVCC1659 strain圖2 3株多殺性巴氏桿菌kmtΙ PCR產(chǎn)物的電泳圖Fig.2 Electrophoresis of kmtΙ PCR products from 3 strains P. multocida

菌株編號(hào)鑒定結(jié)果菌株編號(hào)鑒定結(jié)果菌株編號(hào)鑒定結(jié)果CVCC44401多殺性巴氏桿菌CVCC1966多殺性巴氏桿菌CVCC429多殺性巴氏桿菌CVCC44408多殺性巴氏桿菌CVCC3048BacteriumNLAECVCC430多殺性巴氏桿菌CVCC1657多殺性巴氏桿菌CVCC386多殺性巴氏桿菌CVCC427多殺性巴氏桿菌CVCC1658多殺性巴氏桿菌CVCC387多殺性巴氏桿菌CVCC428多殺性巴氏桿菌CVCC1659多殺性巴氏桿菌CVCC388多殺性巴氏桿菌CVCC431多殺性巴氏桿菌CVCC1660多殺性巴氏桿菌CVCC389多殺性巴氏桿菌CVCC432多殺性巴氏桿菌CVCC1661多殺性巴氏桿菌CVCC390多殺性巴氏桿菌CVCC433多殺性巴氏桿菌CVCC1662多殺性巴氏桿菌CVCC391多殺性巴氏桿菌CVCC434多殺性巴氏桿菌CVCC1694多殺性巴氏桿菌CVCC392多殺性巴氏桿菌CVCC435多殺性巴氏桿菌CVCC1695多殺性巴氏桿菌CVCC393多殺性巴氏桿菌CVCC436多殺性巴氏桿菌CVCC1696多殺性巴氏桿菌CVCC394多殺性巴氏桿菌CVCC437多殺性巴氏桿菌CVCC1697多殺性巴氏桿菌CVCC395多殺性巴氏桿菌CVCC438多殺性巴氏桿菌CVCC1698多殺性巴氏桿菌CVCC396多殺性巴氏桿菌CVCC439多殺性巴氏桿菌CVCC1699多殺性巴氏桿菌CVCC397多殺性巴氏桿菌CVCC440BisgaardTassonCVCC1700多殺性巴氏桿菌CVCC398多殺性巴氏桿菌CVCC441多殺性巴氏桿菌CVCC1701多殺性巴氏桿菌CVCC399多殺性巴氏桿菌CVCC442多殺性巴氏桿菌CVCC1702多殺性巴氏桿菌CVCC400多殺性巴氏桿菌CVCC443多殺性巴氏桿菌CVCC1703多殺性巴氏桿菌CVCC401多殺性巴氏桿菌CVCC444多殺性巴氏桿菌CVCC1704多殺性巴氏桿菌CVCC403多殺性巴氏桿菌CVCC445多殺性巴氏桿菌CVCC1705多殺性巴氏桿菌CVCC420多殺性巴氏桿菌CVCC446多殺性巴氏桿菌CVCC1765多殺性巴氏桿菌CVCC426多殺性巴氏桿菌CVCC8201Enterococcusfaecalis

2001年國(guó)外學(xué)者Townsend通過(guò)消減雜交確定了多殺性巴氏桿菌種特異性基因kmtΙ，針對(duì)該特異性DNA序列設(shè)計(jì)引物，所有的多殺性巴氏桿菌都可以擴(kuò)增出一個(gè)460 bp的片段，由此建立了多殺性巴氏桿菌定種的PCR鑒定方法[12]。Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2014已將kmtΙ作為靶基因建立多殺性巴氏桿菌的PCR診斷技術(shù)，用于出血性敗血癥的病原鑒定。雖然基于kmtΙ基因種特異性PCR方法與16S rDNA PCR方法試驗(yàn)結(jié)果的符合率為100%，但鑒于采用基于kmtΙ基因種特異性PCR方法對(duì)多殺性巴氏桿菌定種無(wú)需測(cè)序及序列分析，較16S rDNA PCR方法在應(yīng)用上更加快捷，故擬將基于kmtΙ基因種特異性PCR方法增添至行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中以實(shí)現(xiàn)豬巴氏桿菌病病原的快速鑒定，從而滿足豬巴氏桿菌病快速診斷的需求。

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(編輯：李文平)

Application of PCR for Identification ofPasteurellamultocida

ZHANG Yuan, LI Jian, LI Wei-jie, WEI Cai-wen, JIANG Yu-wen*

(China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081, China)

JIANG Yu-wen, E-mail: jiangyuwen@ivdc.org.cn

In order to revise the industry standard Diagnostic Techniques of Swine Pasteurella (NY/T 564-2002), 16S rDNA sequence analysis was added to identifyPasteurellamultocida. 63 strains ofPasteurellamultocidafrom swine in China Veterinary Culture Collection Center(CVCC) were check identified with 16S rDNA sequence analysis. 60 strains of 63 strains suspectedPasteurellamultocidawere identified asPasteurellamultocida.PasteurellamultocidakmtΙPCR identification method was constructed and applied to identify the above 60 strains ofPasteurellamultocida. As a result, expected size DNA was amplified.The result is accordant with data of 16S rDNA sequence analysis. The result indicates thatPasteurellamultocidakmtΙPCR identification method can be added to the industry standard Diagnostic Techniques of SwinePasteurellaasPasteurellamultocidaidentification method besides original biochemical identification method.

Pasteurellamultocida;16S rDNA;kmtΙ; sequence analysis

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.5.04

農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂(農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全)項(xiàng)目(572-2014)

張媛，副研究員，從事需氧菌類生物制品的檢測(cè)工作。李建，助理研究員，從事需氧菌類生物制品的檢測(cè)工作，為共同第一作者。

蔣玉文。E-mail:jiangyuwen@ivdc.org.cn

2016-11-29

A

1002-1280 (2017) 05-0016-06

S852.612