冷雪，董鵬，胡桂學，李建明，劉 藝，孫志博，張姍姍，杜銳

(吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春 130118)

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CpG ODN對水貂免疫增強效果的研究

冷雪，董鵬，胡桂學，李建明，劉 藝，孫志博，張姍姍，杜銳*

(吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春 130118)

為獲得對水貂具有免疫刺激活性的CpG ODN序列，設計合成了45種含不同CpG基序的DNA序列，應用MTS比色法測定合成CpG ODNs刺激水貂PBMC增殖的能力，結果有11條CpG ODN對水貂PBMC有刺激活性(SI>2)；應用SI值大于5的6種CpG ODN分別與水貂偽狂犬滅活疫苗聯(lián)合免疫水貂，免疫后經(jīng)水貂血清抗偽狂犬中和抗體效價測定和水貂PBMC非特異性增殖效應檢測，結果有3個CpG ODN序列對水貂具有較好免疫增強作用，分別是CpG-21(ATCGATTTGTCGTTATCGAT)、CpG-23(ATCGATGAACGTTAACGTTTC)和CpG-24(AACGTTCATCGA￣TATCGATGT)。本研究獲得3條對水貂具有較好免疫刺激活性的CpG ODN序列，可為水貂新型CpG佐劑的研究提供參考。

CpG ODN；佐劑；水貂；細胞增殖

含非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(CpG ODN)通過與細胞中的TLR9結合，能刺激人及哺乳動物的天然免疫系統(tǒng)，誘導產(chǎn)生以Th1型為主的天然免疫應答[1-2]，在作為佐劑方面顯示出巨大的應用潛力。根據(jù)CpG ODN的結構和對人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)作用的不同，可將其分為3種類型：A型(或D型)、B型(或K型)和C型。A型CpG ODN能夠直接刺激pDC分泌高水平IFN-α/β。同時，通過Ⅰ型IFN的作用，A型CpG ODN還能夠促進單核細胞向DC發(fā)展，促進其CD80、CD86、MHCII分子表達的上調；間接活化NK細胞，刺激IFN-γ誘導蛋白(IFN-γ inducible protein-10, IP-10)的產(chǎn)生，進而誘導IFN-γ的產(chǎn)生。B型CpG ODN能刺激B細胞增殖和活化，刺激IgM和IL-6的分泌增加；C型CpG ODN兼有A型和B型CpG ODN的免疫刺激活性，既能誘導pDC分泌高水平的IFN-α，又能刺激B細胞活化增殖[3-5]。3種類型的CpG ODN中，由于B型具有強大的促進體液免疫和細胞免疫應答的作用，因此，近年來已被作為新型佐劑用于多種疫苗的研究[6-8]。

目前，針對于動物用新型佐劑CpG ODN的研究主要集中于牛、豬、雞和犬等，而對水貂具有免疫刺激活性的CpG ODN序列的研究尚未報道，因此，本研究以對不同種類動物具有免疫刺激活性的CpG基序為核心，設計合成多條CpG ODN序列，分析其對水貂的免疫刺激活性，獲得了3條對水貂具有較好免疫刺激活性的CpG ODN序列，為水貂用新型CpG佐劑的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 IMDM細胞培養(yǎng)液和MEM細胞培養(yǎng)液均購自Gibco公司；胎牛血清、外周血單個核細胞分離試劑盒均購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；ConA購自上海研生實業(yè)有限公司；MTS購自Promega公司。

1.1.2 細胞和病毒 豬睪丸細胞由本實驗室保存。偽狂犬病毒JL1株，由本實驗室分離鑒定。

1.1.3 疫苗和實驗動物 偽狂犬滅活疫苗由實驗室應用分離的偽狂犬病毒JL1株經(jīng)滅活后與ISA206佐劑混合制備，每毫升病毒含量為107.0TCID50。新生2月齡健康水貂，體重約600 g，均為雌性水貂，未進行疫苗接種，購自黑龍江帽兒山水貂養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1.2.1 CpG ODN的設計合成 根據(jù)文獻報道的分別對人、豬、犬和貓有效的CpG基序，包括GTCGTT、GACGTT、GACGAT、ATCGAT、AACGTT，設計合成45條CpG ODN序列；GC-ODN為不含CpG基序的陰性序列；全部CpG ODN的核酸骨架進行硫代修飾，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 水貂外周血PBMC的分離和培養(yǎng) 水貂心臟采血，用含肝素的無菌真空采血管收集血液，將血液于室溫以250 r/min離心10 min，棄去血漿。按照外周血單個核細胞分離試劑盒使用說明，加入棄去血漿體積1.5倍的稀釋液，輕輕混勻。將經(jīng)稀釋處理的血液緩慢加入等量的分離液液面上，400 r/min室溫離心20 min。吸棄分離液上層0.5 cm以上的上清液，吸取剩余分離液層及單個核細胞層，加入10 mL細胞洗滌液，混勻。250 r/min室溫離心10 min，棄上清，加入5 mL細胞洗滌液重懸細胞，250 r/min室溫離心10 min，棄上清。重復洗滌一次，加入5 mL含10%胎牛血清的IMDM營養(yǎng)液重懸細胞，吹打均勻，取出部分細胞計數(shù)待用。

1.2.3 CpG ODN刺激水貂PBMC增殖能力檢測將水貂PBMC濃度調至4.0×106個/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。分別加入陰性對照GC-ODN和設計合成的45條CpG ODN，CpG ODN的終濃度為10 μg/mL；陽性對照孔加入ConA溶液，終濃度為10 μg/mL；空白組加入與CpG ODN等體積的PBS，每組3個復孔。將96孔細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束前4 h每孔加入20 μL MTS溶液，培養(yǎng)結束后立即用酶標儀檢測各孔波長490 nm的OD值，計算刺激指數(shù): SI=(OD樣品-OD空白)/(OD陰性-OD空白)。

1.2.4 動物分組及免疫 將試驗水貂隨機分成8組，每組5只。疫苗組，每只注射偽狂犬滅活疫苗1 mL；疫苗+CpG ODNs組，每只注射1 mL偽狂犬滅活疫苗和80 μg CpG ODNs，所使用CpG ODNs為對水貂PBMC具有刺激活性，且SI值大于5的CpG-2、CpG-7、CpG-10、CpG-21、CpG-23和CpG-24，分別與疫苗聯(lián)合免疫；對照組，每只注射1 mL滅菌PBS液；注射部位均為后腿部肌肉。各組水貂均于初次免疫后2 周加強免疫1 次，注射部位及劑量與初次免疫相同。首次免疫當日，免疫后7、14、21和28 d分別采血，分離血清，使用Spearman-Karber法計算中和抗體效價，中和抗體效價大于1︰2為陽性，中和試驗中使用偽狂犬病毒滴度范圍為500～3000 TCID50/mL。

1.2.5 免疫后水貂PBMC非特異性增殖效應1.2.4中水貂二次免疫后14 d，心臟采血，用含肝素的無菌真空采血管收集血液，按照1.2.2中方法分離水貂PBMC，按照1.2.3中方法將水貂PBMC接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每個樣品設3個重復，每孔加入終濃度為10 μg/mL的ConA，同時每個樣品設不加ConA的自然增殖孔作為對照。將96孔細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束前4 h每孔加入20 μL MTS溶液，培養(yǎng)結束后立即用酶標儀檢測各孔波長490 nm的OD值。

2 結 果

2.1 CpG ODN刺激水貂PBMC增殖能力檢測

由表1可知，淋巴細胞轉化方法測定45條CpG ODN刺激水貂PBMC增殖能力，有11個CpG ODN序列對水貂PBMC具有刺激活性(SI>2)(表1)，其所含CpG基序分別為ATCGAT、AACGTT、GTCGTT，其中CpG-2(TCAACGTTGAACGTTTAACGTTA)、CpG-7(ATCGATATCGATATCGAT)、CpG-10(TCAACGTTCCAACGTTT)和CpG-21(ATCGATTTGTCGTTATCGAT)四條序列的SI值均大于5，CpG-23(ATCGATGAACGTTAACGTTTC)和CpG-24(AACGTTCATCGATATCGATGT)二條序列的SI值均大于10。

表1 對水貂PBMC具有刺激活性的CpG ODN序列Tab 1 CpG ODN sequence with stimulatory activity to mink PBMC

2.2 CpG ODN序列對水貂偽狂犬滅活疫苗中和抗體效價的影響 由圖1可知，將偽狂犬滅活疫苗分別與CpG-2、CpG-7、CpG-10、CpG-21、CpG-23和CpG-24聯(lián)合免疫水貂，免疫前各組水貂抗偽狂犬病毒中和抗體水平均小于1︰2，初次免疫后第14 d，疫苗組和疫苗+CpG ODNs組水貂血清中開始產(chǎn)生抗偽狂犬病毒中和抗體，初次免疫后第21 d和28 d各免疫組中和抗體水平均明顯高于對應組第14 d的中和抗體水平(圖1)。其中疫苗+CpG-23組血清中和抗體效價高于疫苗單獨接種組和其他疫苗+CpG ODNs組，且差異顯著(P<0.05)；疫苗+CpG-24組血清中和抗體效價高于疫苗單獨接種組和疫苗+CpG-2組、疫苗+CpG-7組和疫苗+CpG-10組；疫苗+CpG-21組與疫苗+CpG-10組血清中和抗體效價無明顯差異，但明顯高于疫苗組和疫苗+CpG-2組、疫苗+CpG-7；疫苗組、疫苗+CpG-2組、疫苗+CpG-7組和疫苗+CpG-10組間血清中和抗體效價無明顯差異(P>0.05)。試驗期內，空白對照組水貂血清始終未檢測到抗偽狂犬病毒中和抗體。

同一時間點各組抗體水平標注不相同字母者為差異顯著(P<0.05);免疫0 d各組水貂抗偽狂犬病毒中和抗體均為陰性，因此未在圖中顯示At the same time point, each group of antibody levels are marked with different letters show the difference was significant (P<0.05) .Immunization 0 d each group of mink anti-pseudorabies virus neutralizing antibody were negative, so not shown in the figure圖1 不同CpG ODN序列與疫苗聯(lián)合免疫后水貂血清中和抗體水平Fig 1 Neutralizing antibody level of mink serum after immunization with different CpG ODN sequences and vaccine

2.3 水貂PBMC非特異性增殖效應 由表2可知，與對照組相比，疫苗組、疫苗+CpG ODNs組水貂PBMC經(jīng)ConA誘導的增殖反應均明顯增強，且差異顯著(P<0.05)；疫苗+CpG-23組、疫苗+CpG-24組水貂PBMC經(jīng)ConA誘導的增殖反應高于疫苗組和其它疫苗+CpG ODNs組，且差異顯著(P<0.05)；疫苗+CpG-10組和疫苗+CpG-21組間無顯著差異，高于疫苗組、疫苗+CpG-2組和疫苗+CpG-7，且差異顯著(P<0.05)；疫苗+CpG-2組、疫苗+CpG-7和疫苗組間無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

CpG ODN作為新型佐劑，其作用機理主要為通過與細胞中的TLR9結合，激活機體的天然免疫應答，促進抗病毒細胞因子及抗體的產(chǎn)生，從而增強疫苗的免疫保護效果。CpG ODN作為疫苗佐劑在人用乙肝疫苗已進入臨床階段。在與動物疫苗，如雞新城疫疫苗、豬繁殖障礙與呼吸道綜合征疫苗和犬瘟熱疫苗等聯(lián)合使用中也表現(xiàn)出較好的增強作用[9-11]。不同類型CpG ODN佐劑效應存在很大差異，在影響CpG ODN免疫刺激活性的各種因素中起到最關鍵作用的是以CpG為核心的六核苷酸基序，研究表明CpG基序GTCGTT對人及多種哺乳動物敏感，CpG基序GACGTT對鼠敏感，CpG基序GTCGTT和ATCGAT對豬敏感，CpG基序AACGTT對犬敏感[12-14]。由于目前還沒有水貂敏感基序方面的報道，本研究參考多種CpG六核苷酸基序設計合成CpG ODN序列，經(jīng)體外淋巴細胞轉化試驗和動物免疫試驗，結果表明，CpG-21、CpG-23和CpG-24對水貂具有較好的免疫刺激活性，其所含CpG基序分別為GTCGTT、ATCGAT和AACGTT，其中CpG-21所含CpG基序為ATCGAT和GTCGTT，CpG-23和CpG-24所含CpG基序均為AACGTT和ATCGAT，而CpG-23和CpG-24對水貂的免疫增強作用更為明顯，說明AACGTT基序和ATCGAT基序組合可能對水貂具有更好的刺激活性。對于CpG基序的研究多集中于單個CpG六核苷酸基序的重復，本研究將不同CpG基序進行組合，并取得了較好的刺激效果，為CpG ODN的設計提供參考。近年來，水貂感染偽狂犬病毒的病例不斷增加，而目前尚無用于水貂偽狂犬病防控的疫苗，因此，本研究選擇偽狂犬病毒作為試驗毒株，為進一步水貂偽狂犬病疫苗的研究奠定基礎。

表2 各組水貂PBMC非特異性增殖效應Tab 2 Non-specific proliferation of mink PBMC in various groups

同一行中含有不相同字母者為差異顯著(P<0.05)

The same column contains different letters show the difference was significant (P<0.05)

綜上所述，本研究獲得3條對水貂具有較好免疫刺激活性的CpG ODN序列，為進一步開發(fā)適用于水貂的新型CpG ODN佐劑提供重要依據(jù)。

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(編輯：李文平)

Study on Immune Enhancement Effect of CpG ODN on Mink

LENG Xue, DONG Peng, HU Gui-xue, LI Jian-ming, LIU Yi, SUN Zhi-bo, ZHANG Shan-shan, DU Rui*

(College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

DU Rui, E-mail: durui71@126.com

Forty-five DNA sequences containing different CpG motifs were designed and synthesized to obtain the CpG ODN sequence with immunostimulatory activity against mink. MTS colorimetric assay was used to determine the ability of CpG ODNs to stimulate the proliferation of mink PBMC. The result showed that eleven CpG ODN has the stimulation activity to the PBMC of mink (SI>2). Six CpG ODNs with SI values more than 5 were used to immunize minks with mink pseudorabies inactivated vaccine respectively. Post immunization, the neutralizing antibody titer of anti-pseudorabies antibodies in mink serum was determined and the non-specific proliferation of mink PBMC was tested. The result showed that the CpG-21 (ATCGATTTGTCGTTATCGAT), CpG-23 (ATCGATGAACGTTAACG￣TTTC), and CpG-24 (AACGTTCATCGATATCGATGT), respectively, which showed a good immunopotentiating effect on mink. In this study, three CpG ODN sequences with good immunostimulatory activity against mink were obtained, which can be used as a reference for the study of new CpG adjuvants in mink.

CpG ODN; adjuvants; mink; proliferation

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.5.02

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20140307008NY，20140412009XH)

冷雪，博士，從事動物病毒學與生物制品學方向研究。

杜銳。E-mail:durui71@126.com

2016-11-29

A

1002-1280 (2017) 05-0007-05

S858.92