曹葳蕤　魏　月　吳黎明（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所 農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，北京100093）

蜂蜜中煙曲霉素殘留的測定

曹葳蕤魏月吳黎明
（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所 農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，北京100093）

本文建立并優(yōu)化了蜂蜜中煙曲霉素的HLPC－MS/MS分析方法。該方法的檢出限為2 μg/kg，線性范圍為1～1000 μg/L，R2為0.9992，在三個加標(biāo)水平下，回收率在72.09～92.09%之間，批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在2.7～10.32%和5.2～11.1%。方法適用于蜂蜜中煙曲霉素殘留的測定。

蜂蜜；煙曲霉素；分析方法

1　前言

近年蜜蜂微孢子蟲在全世界流行，尤其是近十幾年發(fā)現(xiàn)的東方蜜蜂微孢子蟲，對蜂產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失［1］。煙曲霉素被認(rèn)為是治療蜜蜂微孢子蟲病特效藥［2］，它是從煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）中分離的一種抗生素，具有突出的抗寄生蟲效果［3］。然而由于知識產(chǎn)權(quán)、貿(mào)易保護等因素，蜂用煙曲霉素還沒有在我國授權(quán)使用。為了爭取煙曲霉素能被我國農(nóng)業(yè)獸藥管理部門允許在蜂群中使用，充分發(fā)揮其在治療日益嚴(yán)重的蜜蜂微孢子蟲病中的作用，避免甲硝唑等禁用藥物的使用，有必要開展煙曲霉素在蜂產(chǎn)品中代謝降解規(guī)律等基礎(chǔ)性研究。

關(guān)于煙曲霉素殘留的分析方法已有一些報道［4-8］，主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS），液相色譜質(zhì)譜法（HPLC/MS），高效液相色譜法（HPLC）。其中高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）結(jié)合了高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)點，分離能力強、選擇性好、靈敏度高，能達到更好檢出限，其多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式 （Multi-reactions monitoring，MRM）的選擇性高。因此本文選擇高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對蜂蜜中的煙曲霉素進行研究。

本實驗優(yōu)化了蜂蜜中煙曲霉素的提取和HPLCMS/MS分析條件，建立了適用于高通量分析蜂蜜中的煙曲霉素殘留的測定方法。為研究煙曲霉素在蜂巢體系和蜂產(chǎn)品中的變化規(guī)律研究提供了方法支持。

2　材料、試劑與儀器

2.1主要材料、試劑

蜂蜜，北京香山地區(qū)產(chǎn)

C18固相萃取小柱（6 ml/500 mg，美國Waters公司）；

Oasis HLB固相萃取柱（6 ml/500 mg，美國Waters公司）；

QuEChERS試劑盒（美國Agilent公司）；

Zorbax SB-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；

Zorbax XDB-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；

Poroshell 120SB-C18色譜柱 （100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯均為色譜純（美國MREDA technology公司）；

水為超純水，用milli-Q超純水系統(tǒng)制備（美國Millipore公司）。

2.2標(biāo)準(zhǔn)品

煙曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品CSA：23110-15-8，1 mg，純度98%（北京百靈威科技有限公司），用1 ml甲醇溶解，配制成濃度為1.0 mg/ml的煙曲霉素貯備液，保存于-20℃冰箱中備用。

2.3儀器與設(shè)備

Agilent 6460高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；

固相萃取裝置（美國Waters公司）；

CR22GⅡ高速冷凍離心機（日本日立公司）；

N-EVAP112氮氣吹干儀（美國OA-SYS公司）；

QB-210試管翻轉(zhuǎn)混合器（海門市其林貝爾儀器公司）；

Milli-Q純水機（美國Millinpore公司）。

2.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

用甲醇稀釋將濃度為1.0 mg/ml煙曲霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成1000 μg/L、500 μg/L、200 μg/L、100 μg/L、10 μg/L 和1 μg/L的工作液。

2.5色譜條件和質(zhì)譜條件

2.5.1高效液相色譜條件

色譜柱：PoroshellSB-C18柱（2.1×100 mm，2.7μm）；

流動相：0.1%甲酸水溶液（A）+乙腈（B）；

流速：0.2 ml/min；

梯度：0min，45%B；3～6.5min，90%B；6.6～15 min，45%B；

柱溫：30℃；

進樣量：5 μl。

2.5.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式，檢測方式采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，氣體溫度（Gas Temp）300℃，氣體流速（Gas Flow）6 L/min，噴霧器壓力（Nebulizer）45 psi，鞘氣溫度（Sheath Gas Temp）350℃，鞘氣流速（Sheath Gas Flow）9 L/min，毛細(xì)管正電壓3500 v。

2.6樣品處理方法

取5 g蜂蜜樣品用10 ml純水溶解，8000 r/min離心5 min。吸取上清液于Oasis HLB固相萃取柱（使用前用5 ml甲醇和5 ml純水活化）中進行凈化。樣品溶液全部流出后，用10 ml純水淋洗HLB小柱，負(fù)壓下抽干，用6 ml乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，40℃下氮氣吹干，用1ml甲醇復(fù)溶，將溶液過0.22 μm尼龍濾膜后待測。對于超過線性濃度樣品，稀釋后重新測定。

3　結(jié)果和討論

3.1儀器條件的優(yōu)化

3.1.1色譜柱的選擇

由圖1煙曲霉素的結(jié)構(gòu)可知，煙曲霉素是一種弱極性物質(zhì)，一般采用反相色譜柱對其進行分析。文獻報道中一般采用苯基柱和C18柱等反相色譜柱來分離［6］。本研究對三種不同的色譜柱進行比較：Zorbax SB-C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），Zorbax XDB-C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），Poroshell 120，SB-C18（2.7 μm，100 mm× 2.1 mm）。如圖Poroshell 120，SB-C18的可以得到滿意分離效果、較高靈敏度以及良好的峰型。最終，選擇Poroshell 120，SB-C18作為本次試驗的色譜柱。

圖1　煙曲霉素標(biāo)樣的TIC圖

3.1.2流動相及洗脫梯度的優(yōu)化

為了得到最佳的色譜分離效果，提高煙曲霉素測定的靈敏度，本研究對流動相和添加物進行了優(yōu)化。首先對流動相的組成進行了優(yōu)化，比較了使用純水-乙腈，純水-甲醇，0.1%甲酸水-乙腈，0.1%甲酸水-甲醇作為流動相后，色譜峰的保留時間與峰形。結(jié)果表明，乙腈作為有機相，其響應(yīng)值比甲醇高，出峰時間早，這可能是由于乙腈的極性比甲醇強的緣故。流動相中分別加入0.05%、0.1%、0.5%的甲酸，發(fā)現(xiàn)0.1%的甲酸可以明顯提高正模式下母離子加氫峰的強度。

然后對洗脫梯度進行優(yōu)化，最終確定流動A為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈。梯度洗脫程序：0～3 min，45%B；3～6.5 min，90%B；6.6～15 min，45%B。在該梯度洗脫程序下，峰形尖銳，響應(yīng)較高。

3.1.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為了得到最好的定量響應(yīng)，首先將煙曲霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 μg/ml），通過電噴霧離子化直接進入質(zhì)譜進行一級全掃描分析，分別嘗試了三種模式：正模式下加酸（ESI+），負(fù)模式下加酸（ESI－）以及負(fù)模式下不加酸，發(fā)現(xiàn)在正模式加酸的條件下得到的響應(yīng)值最高，因此選擇正離子監(jiān)測模式，得到其穩(wěn)定的［M＋H］+和碎片。在此過程中對一些質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，確定最優(yōu)的碎裂電壓（Fragmentor Voltage）、碰撞能量（Collision Energy）等，以獲最大靈敏度。然后在多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下對其碎片離子進行全掃描，如圖2，得到了4個峰值較大的離子碎片∶m/z427，m/z265，m/z232，m/ z176，滿足歐盟指令（2002/657/EC）中利用質(zhì)譜方法對藥物殘留進行分析確證必須滿足4個識別點的要求［9］。由于m/z 427是煙曲霉素脫水形成的 ［M-H2O］＋，不穩(wěn)定，m/z232峰度比較小，因此選擇質(zhì)荷比（m/z）分別為265.1和 176.9，其中 m/z 179.6作為定量離子，m/z 265.1作為定性離子。

圖2　煙曲霉素全掃描質(zhì)譜圖

3.2前處理方法優(yōu)化

3.2.1QuEChERS方法與固相萃取方法的選擇

選擇合適的萃取方式及萃取柱是決定固相萃取效率的關(guān)鍵因素，可以實現(xiàn)對樣品的凈化濃縮，降低基質(zhì)的干擾，從而改善待檢測物質(zhì)的離子化程度，提高檢測方法的選擇性和靈敏度。

基質(zhì)效應(yīng)是指出目標(biāo)物質(zhì)外的其他成分對于定量分析的綜合影響，一般認(rèn)為是待測組分與樣品基質(zhì)成分在霧滴表面離子化過程中存在競爭所導(dǎo)致，會對目標(biāo)物的離子化效率，使離子強度增加或降低，從而影響檢出限、定量限以及測定結(jié)果的準(zhǔn)確性［10］。本研究中向空白基質(zhì)中添加一定濃度的煙曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品，通過比較實際測定濃度與所添加濃度的比值來評價基質(zhì)影響。若比值大于1，則基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為基質(zhì)增強（用“+”表示），若比值小于1，則表現(xiàn)為基質(zhì)抑制（用“-”表示）。一般情況下，基質(zhì)影響可接受范圍為-20%～10%。

本文章比較了QuEChERS方法與固相萃取方法（Oasis HLB、C18）的提取效果。稱取5.0 g蜂蜜溶于10 ml去離子水中，配制成0.5 g/ml的蜂蜜溶液作為樣品溶液。樣品溶液平行準(zhǔn)備3組，每組3份。分別采用上述三種方法對3組蜂蜜樣品進行前處理后，向每組的3份平行的蜂蜜樣品中分別添加10、50、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行后續(xù)實驗操作，對比四種方法的回收率及基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見表1。

表1　QuEChERS、Oasis HLB、C18提取結(jié)果對比

由表1可知，三個方法都表現(xiàn)為基質(zhì)抑制。采用QuEChERS方法對目標(biāo)物進行提取，回收率較低，且基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重，低濃度添加水平時基質(zhì)影響尤為突出，嚴(yán)重干擾了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。而且，如果研究樣品批次多、樣品量大，若對每批次樣品分別進行基質(zhì)校正，會影響檢測結(jié)果的重復(fù)性。QuEChERS方法雖然具有快速、簡單的優(yōu)勢，更適用于目標(biāo)物質(zhì)的快速篩查。煙曲霉素降解代謝等規(guī)律的研究需要對目標(biāo)物質(zhì)準(zhǔn)確定量，因此QuEChERS方法并不適用。

由表1可知，采用固相萃取方法的Oasis HLB和C18柱子提取煙曲霉素時，凈化效果好，回收率均高于QuEChERS方法，沒有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，因此本研究選擇固相萃取作為提取方法。由結(jié)果可知，Oasis HLB柱子在三個添加濃度下的回收率均高于C18柱，對目標(biāo)物的保留能力較C18柱高。因此，本研究選取HLB柱子對蜂蜜中的煙曲霉素進行提取。

3.2.2淋洗溶液和洗脫溶液的選擇

參考相關(guān)文獻［10］淋洗溶液對純水、2%的甲醇、10%的氨水進行比較，由圖3可知，純水的淋洗對回收率的損失較小，效果最好。

本研究對洗脫溶液（甲醇、乙腈、乙酸乙酯）進行了篩選，并對洗脫液體積進行了優(yōu)化。對比甲醇、乙腈、乙酸乙酯的洗脫效果可知，甲醇、乙腈洗脫物較多，測定時存在雜質(zhì)干擾，且目標(biāo)物回收率低。乙酸乙酯洗脫物種類少、洗脫效果好，目標(biāo)物質(zhì)回收率高，因此實驗中選擇乙酸乙酯作為洗脫溶液。分別采用2、3、4、5、6、7、8、9、10 ml乙酸乙酯對固相萃取柱進行洗脫，對比回收率，結(jié)果見圖4，洗脫液體積由2 ml增加至6 ml時，回收率逐漸升高，此后體積增加，回收率無明顯變化，說明6 ml乙酸乙酯已洗脫完全，因此，本實驗選取6 ml乙酸乙酯作為洗脫溶液。

圖3　淋洗溶液的優(yōu)化

圖4　洗脫溶液體積的優(yōu)化

3.3方法評價

3.3.1線性范圍及檢出限

以水為溶劑稀釋煙曲霉素儲備液，配制質(zhì)量濃度為1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L、500 μg/L、1000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.4中優(yōu)化的實驗條件進行測定。以定量離子的峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，線性范圍在1～1000 μg/ml之間（相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，線性方程y=13.087x-607.94）。配制接近方法檢出限的標(biāo)準(zhǔn)樣品，重復(fù)測定7次，以信噪比為3時對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為的方法的檢出限，為2.0 μg/kg，與以往研究相比，靈敏度更高。

3.3.2方法的添加回收率、精密度

空白蜂蜜樣品中添加一定濃度煙曲霉素儲備液，分別制成5 μg/kg、10 μg/kg和50 μg/kg，每個加標(biāo)水平做5個重復(fù)，連續(xù)做3 d，蜂蜜中煙曲霉素加標(biāo)回收率、批內(nèi)精密度和批間精密度結(jié)果見表2。三個水平添加回收率分別為 80.37～92.09%，78.51～90.32%，72.09～81.86%，日內(nèi)精密度分別為5.6%、2.7%、10.3%，日間精密度分別為9.5%、5.2%、11.1%，均小于20%。

表2　煙曲霉素的添加回收率、精密度

4　結(jié)論

本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/ MS）技術(shù)及固相萃取技術(shù)，建立并優(yōu)化了蜂蜜煙曲霉素殘留的檢測分析方法。經(jīng)方法學(xué)驗證：煙曲霉素在1～1000 μg/L范圍內(nèi)，均具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)（r）為0.9992，本文建立的檢測方法檢出限為2μg/ kg。在5 μg/kg、10μg/kg和50μg/kg三個加標(biāo)水平下，回收率在72.09～92.09%之間，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.7～10.32%之間，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.2～11.1%之間。本方法操作簡單、靈敏度高適用于大批量蜂蜜中煙曲霉素殘留檢測。

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Determination of fumagillin residues in honey

Cao WeiruiWei YueWu Liming
（Institute of Apicultural Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences Bee Product Quality Supervision and Testing Center，Ministry of Agriculture，Beijing 100093，China）

Abstract∶A method was developed to determinate fumagillin in honey using HPLC-MS/MS.The method was validated∶limit of detection（LOD）was 2 μg/kg；R2was 0.9992 when the linear ranged from 1 to 1000 μg/L；and the recoveries were between 72.1%and 92.1%with the intra-RSD of 2.7～10.3%and inter-RSD of 5.2～11.1%at three spiked levels.The developed method has been used to detect fumagillin residue in real samples.

honey，fumagillin，analytical method

吳黎明，E-mail:apiswu@126.com，Tel：010-62594643。