郭冰玉，張　宇，回　薔，全亮亮，陶　凱

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青藤堿增強(qiáng)表柔比星對(duì)黑色素瘤細(xì)胞侵襲的抑制作用

郭冰玉，張宇，回薔，全亮亮，陶凱*

目的初探青藤堿如何增強(qiáng)表柔比星對(duì)黑色素瘤細(xì)胞侵襲的抑制作用。方法應(yīng)用Transwell方法檢測(cè)不同處理因素對(duì)A375細(xì)胞侵襲的影響。處理因素分為4組，分別為：生理鹽水組(對(duì)照)，表柔比星處理組、青藤堿處理組和兩種藥物聯(lián)合處理組。通過(guò)Western blot及Real-time PCR檢測(cè)不同因素作用下侵襲相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果5 μg/mL表柔比星、10 μg/mL青藤堿以及兩種藥物聯(lián)合處理組24 h后對(duì)A375細(xì)胞侵襲的抑制率分別為20.40%±4.63%、14.40%±2.67%和50.32%±3.02%。藥物聯(lián)用后對(duì)A375細(xì)胞侵襲的抑制作用顯著高于各單藥組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。青藤堿可以增強(qiáng)表柔比星對(duì)侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的抑制作用。結(jié)論低濃度青藤堿(10 μg/mL)可以顯著增強(qiáng)低濃度表柔比星(0.1×PPC)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞A375細(xì)胞侵襲的抑制作用，青藤堿可以作為化療過(guò)程中的輔助用藥，起到優(yōu)化治療效果的作用。

青藤堿；表柔比星；A375；黑色素瘤

0　引言

雖然黑色素瘤只占皮膚腫瘤的5%[1-2]，但是仍有75%的皮膚腫瘤所致死亡患者死于黑色素瘤[3-4]。黑色素瘤的轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，預(yù)后較差，生存期短[5-6]。侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致黑色素瘤患者死亡的主要原因[7]，惡性黑色素瘤早期就可以出現(xiàn)淋巴結(jié)、肝、肺、腦等多處轉(zhuǎn)移，患者一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，預(yù)后很差[8]。因此，需要尋找新的治療方案治療黑色素瘤。

青藤堿(Sinomenine)是從青風(fēng)藤中分離出的一種生物堿單體，常用于抗炎、降血壓、鎮(zhèn)咳鎮(zhèn)痛等治療。它對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖也有很強(qiáng)的抑制作用，但是對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究較少，目前尚無(wú)作為化療輔助藥物方向的研究[9]。表柔比星(Epirubicin)屬于抗生素類(lèi)抗腫瘤藥，可以阻止RNA形成，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，對(duì)于很多侵襲性強(qiáng)的腫瘤效果顯著[10]。但是臨床應(yīng)用時(shí)，會(huì)導(dǎo)致很強(qiáng)的胃腸道反應(yīng)。

本研究以黑色素瘤A375細(xì)胞作為研究對(duì)象，初探青藤堿聯(lián)合表柔比星對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制作用，以期改善化療藥物治療黑色素瘤的使用劑量，降低患者化療后的不良反應(yīng)。

1　材料與方法

1.1材料人黑色素瘤A375細(xì)胞株(實(shí)驗(yàn)室凍存)，DMEM培養(yǎng)基(invitrogen)，胎牛血清(天津?yàn)?，青藤堿(Selleck)，表柔比星注射液(健擇)，結(jié)晶紫(碧云天)，抗體：MMP-2、MMP-9和GAPDH(Santa)，SYBR Green(Promega)，Matrigel(Bio rad)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含50 IU/mL青霉素，50 IU/mL鏈霉素)培養(yǎng)A375細(xì)胞株，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2藥物處理濃度表柔比星為臨床常用的化療藥物，根據(jù)lin burg公式C=20 D[C單位為μg/mL，D為臨床劑量單位mg/(kg·d)]和體表面積計(jì)算公式S=1.15+(m-30)×0.1÷5(其中m>30 kg)計(jì)算所需藥物濃度，表柔比星設(shè)中[1×PPC(Peak plasma concentration)]和低(0.1×PPC)兩個(gè)濃度。青藤堿取10、20 μg/mL兩個(gè)濃度。空白對(duì)照組為生理鹽水處理組。

1.2.3Transwell實(shí)驗(yàn)4 ℃過(guò)夜溶解Matrigel，用預(yù)冷的培養(yǎng)基以1∶9稀釋Matrigel,稀釋后每個(gè)小室、上室加入50 μL，37 ℃、5% CO2孵箱孵育30 min，Matrigel聚合成凝膠后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1×105/mL濃度接種于上室中，終體積200 μL，下室加入600 μL雙無(wú)培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基，加入不同處理因素，各組均設(shè)3個(gè)副孔。24 h后取出小室，棉簽擦去上層細(xì)胞，PBS清洗后95%乙醇固定20 min，1%結(jié)晶紫染色20 min。200倍顯微鏡下觀察。藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率計(jì)算公式為：抑制率=1-(劑量組平均細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組平均細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成的1×106/L細(xì)胞懸液接種于6孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，加入不同處理因素。藥物作用24 h后收集細(xì)胞，提取蛋白后每個(gè)加樣孔上樣40 μg蛋白。電泳、轉(zhuǎn)膜后，用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h。TBST洗膜3次后孵育一抗4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜3次后，室溫孵育二抗1 h。洗膜3次后ECL發(fā)光儀發(fā)光?；叶戎低ㄟ^(guò)Image J軟件測(cè)得。

1.2.5Real-time PCR檢測(cè)蛋白R(shí)NA表達(dá)水平通過(guò)TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照SYBR Green實(shí)際和說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。所用引物為MMP-2，F(xiàn)(5′-3′)：CGCATCTGGGGCTTTAAAC；R(5′-3′)：CAGCACAAACAGGTTGCAG；MMP-9，F(xiàn)(5′-3′)：CGACGTCTTCCAGTACCGAG；R(5′-3′)：GTATCCGGCAAACTGGCT；GAPDH，F(xiàn)(5′-3′)：CATCCCTTCTCCCCACACAC；R (5′-3′)：AGTCCCAGGGCTTTGATTTG。

2　結(jié)果

2.1不同藥物處理組對(duì)A375細(xì)胞侵襲的影響不同濃度表柔比星、青藤堿作用A375細(xì)胞24 h后，結(jié)果顯示，表柔比星、青藤堿可抑制A375細(xì)胞侵襲，各組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表柔比星、青藤堿對(duì)細(xì)胞的侵襲抑制作用與劑量呈正比關(guān)系。5 μg/mL表柔比星與10 μg/mL青藤堿聯(lián)合使用對(duì)A375細(xì)胞侵襲的抑制起協(xié)同作用，青藤堿能夠顯著提高表柔比星對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制作用。各組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表1～表3、圖1～圖6。

表1　不同劑量表柔比星對(duì)A375細(xì)胞侵襲的抑制率(n=3)

圖1　不同劑量表柔比星作用下A375細(xì)胞的侵襲情況(n=3)

圖2　不同劑量表柔比星對(duì)A375細(xì)胞侵襲的抑制率(n=3)

表2　不同劑量青藤堿對(duì)A375細(xì)胞侵襲的抑制率(n=3)

圖3　不同劑量青藤堿作用下A375細(xì)胞的侵襲情況(n=3)

圖4　不同劑量青藤堿對(duì)A375細(xì)胞侵襲的抑制率(n=3)

表3　表柔比星、青藤堿單獨(dú)使用以及聯(lián)合應(yīng)用時(shí)細(xì)胞侵襲的抑制作用(n=3)

2.2不同處理組對(duì)A375細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白的影響如圖7～圖9所示，與對(duì)照組比較，不同藥物作用下，MMP-2和MMP-9在蛋白水平及RNA水平均受到了抑制。當(dāng)表柔比星與青藤堿聯(lián)合應(yīng)用時(shí)蛋白被抑制的程度增強(qiáng)。

圖5　表柔比星、青藤堿單獨(dú)使用以及聯(lián)合應(yīng)用時(shí)細(xì)胞的侵襲情況(n=3)

圖6　表柔比星、青藤堿單獨(dú)使用以及聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制作用(n=3)

圖7　不同處理因素作用下A375細(xì)胞蛋白的變化

圖8　不同處理因素作用下A375細(xì)胞蛋白的變化

圖9　不同處理因素作用下A375細(xì)胞蛋白R(shí)NA水平的影響

3　討論

腫瘤的轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的典型特征，也是腫瘤致死的最主要原因。黑色素瘤早期識(shí)別治療可以治愈[11]，但其惡性程度極高，經(jīng)常發(fā)生淋巴結(jié)等部位的遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移，占皮膚腫瘤死亡病例的極大部分。因此，尋找毒副作用小的防止黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物很有必要[12]。目前的化療藥物大多有使用濃度高、毒副作用強(qiáng)的弊端[13]。所以，尋找協(xié)同作用藥物是很有必要的。

青藤堿來(lái)源于防已科植物青藤的根和莖，具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳局麻、降血壓和抗炎等作用，實(shí)驗(yàn)研究表明，青藤堿對(duì)肺癌、宮頸癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞的增殖均有抑制作用[14]。報(bào)道指出，它可以促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，啟動(dòng)線(xiàn)粒體凋亡通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]；在Hela細(xì)胞中抑制PI3K信號(hào)通路，抑制增殖，影響p53等蛋白調(diào)控細(xì)胞存活[16]；通過(guò)抑制VEGF和COX-2的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成抑制腫瘤生長(zhǎng)[17]；抑制ERK蛋白的磷酸化，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，抑制其過(guò)度增殖[18]。但是其如何抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移以及將其作為化療藥物協(xié)同藥物的研究比較少。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要蛋白水解酶，MMPs在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，可以破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障。其中，家族中的重要成員MMP-2和MMP-9已被廣泛研究，可以有效降解基底膜的膠原成分和層粘連蛋白，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)[19]。各種靶向藥物也往往通過(guò)抑制MMPs的表達(dá)抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[20]。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)蜐舛惹嗵賶A(10 μg/mL)與低濃度表柔比星(0.1×PPC)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)A375細(xì)胞侵襲的抑制率高于兩者單獨(dú)使用的抑制率之和，起到了協(xié)同作用的效果。與此同時(shí)，藥物聯(lián)用時(shí)，對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的抑制作用顯著強(qiáng)于單個(gè)藥物作用組。由此可見(jiàn)，青藤堿可增強(qiáng)表柔比星對(duì)A375細(xì)胞侵襲的抑制效果。

目前，以青藤堿作為主要成分的藥物有很多，臨床已經(jīng)應(yīng)用的有正清風(fēng)痛寧片、鹽酸青藤堿注射液、毛青藤總堿片等制劑，用于治療慢性腎炎和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。本研究表明，青藤堿除具有鎮(zhèn)痛抗炎作用外，還對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移具有很好的抑制作用，當(dāng)與其他化療藥物聯(lián)用時(shí)，可以對(duì)化療藥物起到增效的作用，加之其來(lái)源廣泛，容易獲取，青藤堿具有很大的深入研究?jī)r(jià)值。

綜上所述，青藤堿與表柔比星聯(lián)合應(yīng)用可以使表柔比星在低濃度時(shí)起到更好的治療效果，降低表柔比星的使用濃度，避免高濃度化療藥物引起的各種毒副作用，為臨床解決黑色素瘤化療難題提供了更多的藥物選擇。

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Study of sinomenine enhances the inhibitory effect of epirubicin on melanoma invasion

GUO Bing-yu,ZHANG Yu,HUI Qiang,QUAN Liang-liang,TAO Kai*

(Department of Plastic Surgery,General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110840,China)

ObjectiveTo study how sinomenine enhances the inhibition of epirubicin on invasion of melanoma cells.MethodsThe effects of different processing factors on the invasion of A375 cells were detected by Transwell.There were four groups of processing factors:NaCl group (control),epirubicin treatment group,sinomenine treatment group and epirubicin combined with sinomenine treatment group.The invasion of A375 cells treated by different concentration of drugs was tested by Tramswell.Then the protein level and RNA level of MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blot and Real-time PCR.ResultsThe 10 μg/mL of sinomenine,5 μg/mL of epirubicin or sinomenine combined with epirubicin were used on A375 cells,the inhibition rate on cell invasion were 14.40%±2.67%,20.40%±4.33% and 50.32%±3.02%.At the same time sinomenine could significantly enhance the inhibition effect of epirubicin on MMP-2 and MMP-9.ConclusionSinomenine combined with epirubicin has a synergistic effect on the inhibition of the invasion of melanoma cells,which can help to promote the treatment effect in chemotherapy.

Sinomenine;Epirubicin;A375;Melanoma

2015-10-12

沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院整形外科，沈陽(yáng) 110840

10.14053/j.cnki.ppcr.201608003