沈　健，張誠(chéng)賢

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HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊中4種成分的含量

沈健1*，張誠(chéng)賢2

目的建立同時(shí)測(cè)定鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊中香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B含量的高效液相色譜法。方法采用依利特C18柱；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)，梯度洗脫；流速：1.3 mL/min；柱溫：26 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)λ1=254 nm (香蒲新苷及異鼠李素-3-O-新橙皮苷)，λ2=285 nm [巴西蘇木素和(±)原蘇木素B]。結(jié)果香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的線性范圍分別為4.62～92.40 μg/mL (r=0.999 2)、5.70～114.00 μg/mL (r=0.999 6)、8.95～179.00 μg/mL (r=0.999 4)、7.79～155.80 μg/mL (r=0.999 7)；香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的平均加樣回收率分別為97.81%、99.16%、97.23%、96.74%，其RSD分別為1.19%、0.84%、1.04%、1.08%。結(jié)論所建立的鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊樣品中，4種成分(香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B)的含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、可靠。

高效液相色譜法；鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊；香蒲新苷；異鼠李素-3-O-新橙皮苷；巴西蘇木素；(±)原蘇木素B

0　引言

鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊是由蒲黃、蘇木、草烏、半夏、川烏、樟腦等17味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，按照《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編·骨傷科分冊(cè)》規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)加工而來，該制劑的主要功效為舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)定痛，主要對(duì)急慢性軟組織損傷、關(guān)節(jié)炎、肩周炎、頸椎病、骨質(zhì)增生、坐骨神經(jīng)痛及勞累損傷等筋骨酸痛病癥有顯著的治療作用[1-2]。原部頒的鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)處方中大黃所含的大黃酚進(jìn)行了含量測(cè)定研究，而鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊是由17種中藥材按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的生產(chǎn)工藝加工制成的復(fù)方制劑，僅控制其中1個(gè)成分不能有效地確保鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊的質(zhì)量。本研究應(yīng)用高效液相梯度洗脫法，對(duì)該制劑的蒲黃、蘇木中的4個(gè)成分-香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B進(jìn)行含量測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器安捷倫1200型HPLC色譜儀；恒溫超聲波提取機(jī)(型號(hào)：VS-100UE，生產(chǎn)廠家：無錫沃信儀器有限公司)；XS205DU型電子天平(梅特勒-托利多)。

1.2試藥香蒲新苷對(duì)照品(批號(hào)：111573-201405，含量：97.0%，常溫保存)、異鼠李素-3-O-新橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)：111571-201205，含量：93.2%，室溫干燥保存)、巴西蘇木素(批號(hào)：111881-201302，含量：94.9%，冷凍避光保存)、(±)原蘇木素B(批號(hào)：111882-201302，含量：89.9%，冷凍干燥避光保存)，以上4種對(duì)照品均來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊(50 mL/瓶；批號(hào)：20140807、20140802、20140701)購(gòu)自上海景峰制藥股份有限公司；試驗(yàn)用乙腈為色譜純，試驗(yàn)用乙醇、磷酸為分析純，試驗(yàn)用水為重蒸餾水。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備取對(duì)照品香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B適量，精密稱定其質(zhì)量，加60%乙醇溶解并稀釋，分別制成香蒲新苷為0.462 mg/mL、異鼠李素-3-O-新橙皮苷為0.570 mg/mL、巴西蘇木素為0.895 mg/mL和(±)原蘇木素B為0.779 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2混合對(duì)照品溶液的制備分別吸取“2.1.1項(xiàng)”下香蒲新苷對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL、異鼠李素-3-O-新橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液3.5 mL、巴西蘇木素對(duì)照品儲(chǔ)備液6.0 mL、(±)原蘇木素B對(duì)照品儲(chǔ)備液5.0 mL，用60%乙醇稀釋，制成每1 mL分別含香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素、(±)原蘇木素B為23.1、39.9、107.4、77.9 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3供試品溶液和空白對(duì)照溶液的制備精密量取鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊2.0 mL，置50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液稀釋至刻度，采用超聲波對(duì)樣品進(jìn)行超聲(250 W，20 kHz)處理5 min，濾過，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾頭過濾，作為供試品溶液。另外，按照鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的處方工藝，分別制備不含蒲黃、蘇木的空白制劑，同法制成蒲黃空白溶液和蘇木空白溶液。

2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)試驗(yàn)用色譜柱采用依利特C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.5%磷酸溶液，按表1規(guī)定的程序進(jìn)行梯度洗脫[3-5]；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～28 min，λ1=254 nm[6-9]，29～54 min，λ2=285 nm[10-11]；流速：1.3 mL/min；柱溫：26 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。在上述規(guī)定的系統(tǒng)條件下，所測(cè)4種成分香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素、(±)原蘇木素B與其他成分均有良好的分離效果，理論塔板數(shù)按香蒲新苷計(jì)算不得低于2 500，分離度均>1.5。

表1　梯度洗脫程序(%)

2.3專屬性試驗(yàn)分別精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液、“2.1.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液以及“2.1.3”項(xiàng)下制備的蒲黃空白溶液和蘇木空白溶液，參照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，在記錄的色譜圖中，按保留時(shí)間先后，所測(cè)4種成分的出峰順序?yàn)椋合闫研萝铡愂罄钏?3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素、(±)原蘇木素B。結(jié)果顯示，供試品溶液和混合對(duì)照品溶液所測(cè)各成分的保留時(shí)間一致；蒲黃空白溶液中未顯示香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷色譜吸收峰；蘇木空白溶液色譜圖中未顯示巴西蘇木素和(±)原蘇木素B吸收峰。表明鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊處方中，其他藥物對(duì)所測(cè)4種成分-香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素、(±)原蘇木素B的測(cè)定無影響，見圖1。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下制備的香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素、(±)原蘇木素B對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分別置于5個(gè)10 mL的容量瓶中，以60%乙醇定容至刻度，振搖均勻，制成5個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液。參照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，測(cè)定香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素及(±)原蘇木素B各成分的峰面積，以峰面積A為縱坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素及(±)原蘇木素B的回歸方程、線性關(guān)系及r值見表2。

2.5精密度試驗(yàn)取文中“2.1.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，參照文中“2.2”項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素、(±)原蘇木素B的峰面積，計(jì)算各成分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差依次為：1.29%、0.97%、0.53%、1.05%。

圖1　鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊中4種成分HPLC色譜圖

表2　線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6重復(fù)性試驗(yàn)按樣品含量測(cè)定方法對(duì)同一批號(hào)的6份鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊樣品進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示，香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.31%、0.89%、0.67%、1.51%，表明重復(fù)性良好。

2.7溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊樣品的同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分RSD，結(jié)果顯示，香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的RSD分別為0.95%、1.51%、0.79%、1.83%，表明供試品溶液在室溫下存放24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)取9份已知含量的鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊[香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B分別為0.617、1.024、2.676、1.971 mg/mL]適量，精密量取1.0 mL，置50 mL容量瓶中，分別精密加入“2.1.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液20、25、30 mL各3份，按照“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，濾過，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾頭過濾，作為加樣供試品試液。參照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算4種成分的回收率，結(jié)果見表3。

2.9樣品測(cè)定取3個(gè)不同批號(hào)的鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊樣品，參照“2.1.3”項(xiàng)下制備供試品溶液的處理方法，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定4種成分的含量，結(jié)果見表4。

3　討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇本研究分別配制一定濃度的各成分對(duì)照品溶液，采用UV-3200PC 紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)在190～400 nm范圍內(nèi)分別進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，結(jié)果香蒲新苷在252 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，異鼠李素-3-O-新橙皮苷在255 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。參考《中國(guó)藥典》(2010年版)蒲黃含量測(cè)定項(xiàng)下的檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，將本試驗(yàn)香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的檢測(cè)波長(zhǎng)定為254 nm。巴西蘇木素在203、286 nm處有較強(qiáng)吸收，(±)原蘇木素B在206、283 nm處有較強(qiáng)吸收，考慮到200 nm附近溶劑有強(qiáng)吸收，同時(shí)參考《中國(guó)藥典》(2010年版)蘇木含量測(cè)定項(xiàng)下的檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm，將本試驗(yàn)巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的檢測(cè)波長(zhǎng)定為285 nm。

表3　加樣回收率試驗(yàn)(n=9)

表4　樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/mL)

3.2流動(dòng)相的選擇筆者曾采用乙腈-水、甲醇-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液不同比例為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果顯示，以乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)按照文中規(guī)定的程序進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，所測(cè)4個(gè)成分-香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的峰形良好，各成分均能達(dá)到基線分離。

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Simultaneous determination of four components in Zhentong Huoluo Ding by HPLC

SHEN Jian1*,ZHANG Cheng-xian2

(1.Huzhou Central Hospital,Huzhou 313000,China;2.Huzhou Institute for Food and Drug Control,Huzhou 313000,China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the simultaneous determination of 4 main components in Zhentong Huoluo Ding,including typhaneoside,isorhamnetin-3-O-neohesperidoside,brazilin and (±) protosappanin B.MethodsA stable HPLC method was established and the chromatography was accomplished on an Hypersil C18column,with a mobile phase consisting of acetonitrile (A) and 0.5% phosphoric acid solution (B) in a gradient elution.The flow rate was set at 1.3 mL/min,and the column temperature was set at 26 ℃.Typhaneoside and isorhamnetin-3-O-neohesperidoside were detected at 254 nm,while brazilin and (±) protosappanin B were detected at 285 nm.ResultsTyphaneoside,isorhamnetin-3-O-neohesperidoside,brazilin and (±) protosappanin B had good linearity at 4.62～92.40 μg/mL (r=0.999 2),5.70～114.00 μg/mL (r=0.999 6),8.95～179.00 μg/mL (r=0.999 4) and 7.79～155.80 μg/mL (r=0.999 7),respectively;the average recovery rates were 97.81% (RSD=1.19%),99.16% (RSD=0.84%),97.23% (RSD=1.04%) and 96.74% (RSD=1.08%),respectively.ConclusionThe developed HPLC method is accurate and reliable for the simultaneous determination of typhaneoside,isorhamnetin-3-O-neohesperidoside,brazilin and (±) protosappanin B in Zhentong Huoluo Ding.

HPLC;Zhentong Huoluo Ding;Typhaneoside;Isorhamnetin-3-O-neohesperidoside;Brazilin;(±)protosappanin B

2016-03-08

1.湖州市中心醫(yī)院，浙江 湖州 313000；2.湖州市食品藥品檢定研究院，浙江 湖州 313000

10.14053/j.cnki.ppcr.201608025