潘莉萍，袁　偉，郭靜明

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熊果酸誘導(dǎo)人急性髓系白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞凋亡的實驗研究

潘莉萍*，袁偉，郭靜明

目的探討熊果酸對人急性髓系白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞的作用及機(jī)制。方法用不同濃度的熊果酸處理對數(shù)生長期的U937細(xì)胞48 h后，采用四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測其對細(xì)胞增殖的影響；Annexin V/PI染色和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；免疫印跡法(Western blot)檢測Wnt、β-catenin、p53、Bcl-2、Bax表達(dá)，以及細(xì)胞漿凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)和細(xì)胞色素蛋白C (CytC)蛋白表達(dá)。結(jié)果熊果酸呈濃度依賴性誘導(dǎo)U937細(xì)胞增殖抑制和凋亡，上調(diào)Bax和細(xì)胞漿AIF、CytC表達(dá)，下調(diào)Wnt、β-catenin、p53及Bcl-2表達(dá)。結(jié)論熊果酸對U937白血病細(xì)胞有顯著的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，其機(jī)制可能為抑制Wnt/β-catenin/p53信號途徑促發(fā)白血病細(xì)胞死亡。

熊果酸；U937；增殖；凋亡；Wnt/β-catenin

0　引言

白血病是好發(fā)于兒童和青壯年的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其死亡率居兒童及35歲以下腫瘤死亡人群的首位[1]。近年來，由于白血病的發(fā)病率和死亡率升高，研究治療白血病的藥物和方法的需求越發(fā)迫切[1-2]。天然植物是抗腫瘤藥物的重要來源，熊果酸又名烏蘇酸，是從女貞子、白花蛇舌草、夏枯草、烏梅等天然植物中提取的活性成分，其結(jié)構(gòu)為五環(huán)三萜類，具有抗菌、抗凋亡等作用，常用于病毒性肝炎等疾病的治療[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸具有抗腫瘤活性，但其對白血病的作用及機(jī)制尚不明確[3-4]。本研究以人白血病細(xì)胞株U937為靶細(xì)胞，探討熊果酸對白血病細(xì)胞株U937的作用及機(jī)制。

1　材料

1.1藥品與試劑熊果酸(Sigma，USA)經(jīng)HPLC鑒定純度超過99%；四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性試劑盒(南京凱基)，Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基，100 μL)，RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO，USA)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Wnt (CST，USA)，β-catenin (CST，USA)，p53 (CST，USA)。β-actin抗體(Abcam，China)，Bcl-2 (CST，USA)，Bax (CST，USA)，AIF (CST，USA)，CytC(CST，USA)。蛋白裂解液RIPA(碧云天，武漢谷歌)，細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒(碧云天，武漢谷歌)，蛋白酶抑制劑cocktail、Western blot凝膠制備試劑盒(武漢谷歌)；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天，PP1001，100 mL)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人白血病細(xì)胞株U937購于中科院細(xì)胞庫，培養(yǎng)于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，生長至占據(jù)75%～85%培養(yǎng)瓶面積時，用胰蛋白酶消化傳代。

1.3儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma scientific，USA)；倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡(日本，Olympus)；酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，USA)。PVDF膜(Roche，瑞士)，ECL試劑盒(Bi-pech，USA)，膠片及化學(xué)發(fā)光儀(Kodak，USA)。

1.4MTT 法檢測U937細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期U937細(xì)胞，按實驗分組加入熊果酸0、10、20、40 μmol/L作用48 h后，將待測的100 μL細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔加入5 g/L MTT液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，加入DMSO 150 μL，振蕩溶解10 min。每組做2個復(fù)孔。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm波長下的吸光度(A)，計算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率=(1-A試驗/A對照)。

1.5Annexin V/PI 雙染檢測U937細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期U937細(xì)胞，按實驗分組加入熊果酸0、10、20、40 μmol/L作用48 h后，將待測的100 μL細(xì)胞懸液加入96孔板中。按Annex5/PI染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，細(xì)胞收集于75%冰乙醇內(nèi)，-20 ℃固定2 h以上，收集細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，PBS漂洗后每孔加入PI染料150 mL，室溫避光孵育30 min后，用流式細(xì)胞儀檢測凋亡，所有實驗重復(fù)3次。

1.6Western blot檢測蛋白表達(dá)收集各濃度組處理的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗后，按照蛋白裂解液RIPA操作說明提取總蛋白，檢測Wnt、β-catenin、p53、Bcl-2及Bax，利用細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞漿蛋白，檢測AIF、CytC，應(yīng)用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取各組細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞漿蛋白樣品100 μg，以樣品中的β-actin為內(nèi)參，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，然后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉2 h，分別加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋p53 (1∶500)、Wnt (1∶500)、β-catenin (1∶500)、Bax (1∶500)、Bcl-2 (1∶500)、CytC (1∶500)、AIF (1∶500)和β-actin (1∶3 000)抗體，4 ℃孵育過夜。PBS洗膜3次，10 min/次，再與1∶2 000稀釋的相應(yīng)二抗室溫反應(yīng)1 h，充分洗滌后，經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測。

2　結(jié)果

2.1熊果酸抑制U937細(xì)胞增殖0、10、20、40 μmol/L熊果酸的抑制率分別為0、10%±5%、30%±5%、50%±5%。表明熊果酸>10 μmol/L能明顯抑制U937細(xì)胞增殖(P<0.05)，且隨著熊果酸濃度的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。見圖1。

圖1　MTT檢測熊果酸對U937細(xì)胞的抑制作用

2.2熊果酸誘導(dǎo)白血病細(xì)胞U937凋亡U937細(xì)胞經(jīng)熊果酸0、10、20、40 μmol/L作用48 h后，隨著濃度的增加，細(xì)胞凋亡比例逐漸增高(見圖2)，細(xì)胞凋亡率分別為8.4%±2.7%、24.3%±3.7%、36.4%±4.7%、57.6%±5.2%，見圖2。

圖2　Annexin V/PI雙染法檢測熊果酸對U937細(xì)胞凋亡的影響

2.3熊果酸對凋亡相關(guān)蛋白的影響U937細(xì)胞經(jīng)熊果酸0、10、20、40 μmol/L作用48 h后，隨著濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加(P<0.05)，見圖3、表1。

圖3　Western blot檢測熊果酸對Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

表1　熊果酸對U937細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4熊果酸對促凋亡誘導(dǎo)蛋白的影響U937細(xì)胞經(jīng)熊果酸0、10、20、40 μmol/L作用48 h后，隨著濃度的增加，細(xì)胞漿中促凋亡誘導(dǎo)蛋白AIF、CytC表達(dá)增加(P<0.05)。見圖4、表2。

圖4　Western blot檢測熊果酸對細(xì)胞漿AIF、CytC表達(dá)的影響

表2　熊果酸對U937細(xì)胞漿中AIF、CytC表達(dá)的影響

注：與對照組比較，**P<0.01

2.5熊果酸對Wnt/β-catenin/p53信號通路的影響U937細(xì)胞經(jīng)熊果酸0、10、20、40 μmol/L作用48 h后，隨著濃度的增加，Wnt、β-catenin、p53表達(dá)減少(P<0.05)。見圖5、表3，提示熊果酸可呈濃度依賴性抑制該信號通路的活化。

圖5　Western blot檢測熊果酸對Wnt、β-catenin和p53蛋白表達(dá)的影響

表3　熊果酸對Wnt、β-catenin和p53蛋白表達(dá)的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3　討論

近期研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸對乳腺癌MCF-7、肺癌A549等多種細(xì)胞具有明顯的毒性殺傷作用[5]，因而作為潛在的抗腫瘤藥物而廣泛研究。而熊果酸對白血病的作用及機(jī)制目前尚不十分明確。

U937為急性髓系白血病細(xì)胞株，目前廣泛用于急性髓系白血病的研究。我們首先利用MTT檢測熊果酸對人急性髓系白血病細(xì)胞株U937活性的影響，結(jié)果顯示，U937細(xì)胞對熊果酸的作用極其敏感。表明熊果酸可劑量依賴性地抑制U937增殖，之后利用Annexin V/PI 雙染法檢測，結(jié)果表明，熊果酸可以明顯促進(jìn)人白血病細(xì)胞U937凋亡，提示熊果酸作為抗白血病藥物具有可行性。為進(jìn)一步證實熊果酸的抗白血病腫瘤的作用機(jī)制，本研究應(yīng)用Western blot測試熊果酸對Wnt/β-catenin/p53和部分凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，熊果酸可以降低Wnt、β-catenin和p53蛋白的表達(dá)，表明熊果酸主要是通過抑制Wnt/β-catenin/p53信號通路影響白血病細(xì)胞的增殖和凋亡。白血病細(xì)胞的凋亡受到抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白表達(dá)的共同調(diào)節(jié)，正常生理情況下兩者呈動態(tài)平衡，而平衡一旦破壞，就會出現(xiàn)細(xì)胞凋亡或永生化(即癌變)[6]，而抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表達(dá)受CytC和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)遷徙的影響，CytC和AIF的遷徙增大表現(xiàn)為細(xì)胞漿中AIF和CytC表達(dá)增加[7]。結(jié)果顯示，熊果酸可促進(jìn)細(xì)胞漿CytC和AIF表達(dá)，增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，減少抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，且降低程度與熊果酸濃度呈正相關(guān)。結(jié)果顯示，熊果酸可通過促進(jìn)CytC和AIF遷徙，上調(diào)Bax且下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)人白血病細(xì)胞的凋亡過程。

綜上所述，本研究證實了熊果酸可抑制人白血病細(xì)胞生長，促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡，并初步研究了熊果酸抗白血病的生理作用機(jī)制，提示其作用機(jī)制與抑制Wnt/β-catenin/p53信號途徑相關(guān)，討論了熊果酸作為治療白血病藥物的可行性。但腫瘤的產(chǎn)生及進(jìn)展是一個極其復(fù)雜的病理生理過程，抗腫瘤藥物的選擇依然十分困難，本研究僅從細(xì)胞角度探討了熊果酸對白血病細(xì)胞的增殖和凋亡方面的作用，結(jié)果提示，Wnt/β-catenin/p53信號通路可能僅是其作用的一個靶點，具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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Study of urosonic acid-induced apoptosis of human acute myeloid leukemia cells U937

PAN Li-ping*,YUAN Wei,GUO Jing-ming

(Department of Hematology,Yichang Central People′s Hospital of the First Clinical Medical College,Three Gorges University,Yichang 443003,China)

ObjectiveTo explore the effects and mechanisms of urosonic acid on human acute myeloid leukemia cells U937.MethodsThe human acute myeloid leukemia U937 cells were treated with different concentrations of urosonic acid for 48 h.The cell growth was examined by MTT assay.Cell apoptosis was determined by Annexin V/PI staining.Moreover,the expression of Wnt,β-catenin,p53,Bcl-2 (apoptosis related protein-2),Bax and the cytoplasm of AIF (apoptosis inducing factor) and cytochrome protein C (CytC) was measured by Western blot.ResultsUrosonic acid could induce the proliferation inhibition and apoptosis of U937 cell,up-regulate the expression of Bax and down-regulate the expression of Bcl-2,Wnt,β-catenin and p53 on U937 cell in a dose-dependent manner.Furthermore,urosonic acid could also increase the expression of AIF and CytC in the cytoplasm.ConclusionUrosonic acid can significantly induce the proliferation inhibition and apoptosis of U937 leukemia cells,the mechanism may be associated with suppressing the activation of Wnt/β-catenin/p53 signaling.

Urosonic acid;U937;Proliferation;Apoptosis;Wnt/β-catenin

2016-02-23

三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院宜昌市中心人民醫(yī)院血液科，湖北 宜昌 443003

10.14053/j.cnki.ppcr.201608005