張會瑞，焦軍東

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lncRNA TP73-AS1對肝細胞癌細胞HepG-2凋亡的影響及其機制

張會瑞，焦軍東*

目的探討肝癌中長鏈非編碼RNA TP73-AS1差異表達，及其對肝癌細胞凋亡的影響與作用機制。方法從TCGA數據庫中下載并處理新一代測序(RNASEQ)數據，利用生物信息學方法獲取顯著的肝癌相關lncRNA與mRNA的共表達網絡。將差異表達lncRNA映射入上述網絡中，利用生物信息學方法預測肝癌相關lncRNA及其功能。通過MTT、AO/EB、Western blot方法對其功能學進行研究。結果共識別25 439對顯著的lncRNA-gene共表達關系。在22個差異的lncRNAs被映射中，TP73-AS1度最高，該lncRNA的62個互作基因映射到病毒致癌作用(Viral carcinogenesis pathway)通路中，并能影響下游MAPK信號通路與p53信號通路。lncRNA TP73-AS1-siRNA影響HepG-2細胞增殖，上調促凋亡蛋白Bax表達，增加Caspase-3活性，下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，使p53蛋白表達升高。結論lncRNA TP73-AS1通過p53途徑調節(jié)肝細胞癌細胞系HepG-2凋亡，為長鏈非編碼RNA成為臨床肝細胞癌患者的有效治療藥物提供了實驗依據。

長鏈非編碼RNA；共表達網絡；肝細胞癌；凋亡

0　引言

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HC)是全世界最常見的惡性腫瘤之一，每年約有60萬患者被診斷出患有肝細胞癌[1]。目前，對于肝細胞癌的治療主要是手術切除、肝臟移植、放化療等[2]，但僅有20%的患者能夠被治療[3-4]。我國肝細胞癌年死亡率占腫瘤死亡率的第2位[5]。肝細胞癌的病因及發(fā)病機制尚未確定[6]，因此，尋找新的肝細胞癌的治療方法是研究重點。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉錄長度超過200核苷酸的RNA[7-8]，其本身并不編碼蛋白或很少有編碼蛋白質的功能[9]。相關研究表明，與正常組織比較，lncRNA在某些腫瘤，如膽囊癌[10]、肝癌[11]、喉癌[12]、胃癌[13]等的腫瘤組織中的表達具有顯著差異，這些異常表達的lncRNA可能在染色質修飾、X染色體失活、轉錄、翻譯、基因印記、劑量補償效應、蛋白質的活性調控及RNA的可變剪切調控等過程中發(fā)揮作用[14-15]。但是，關于lncRNA與肝細胞癌的研究并不完善。

本文利用生物信息學數據庫與計算方法首先預測了肝細胞癌相關的lncRNA，篩選出表達量最高的lncRNA TP73-AS1；研究lncRNA TP73-AS1在肝細胞癌細胞系增殖凋亡的功能，評估lncRNA TP73-AS1在肝細胞癌中的表達及其相關性；就lncRNA TP73-AS1對于肝癌及其作用的分子機制進行了初步研究?，F報道如下。

1　方法與數據

1.1材料人肝細胞癌細胞系HepG-2由哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院普外科丁超饋贈，用DMEM高糖(含10%小牛血清)培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)?？笲cl-2、抗Bax、Bad及p53單克隆抗體(美國Cell Signaling)。

1.2方法

1.2.1MTT法測定HepG-2細胞生長抑制率將1×105/L的HepG-2細胞接種于96孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)細胞中加入lncRNA TP73-AS1-siRNA，轉染48 h。每組設定6個平行孔，并設定空白對照。在吸光度(A570)檢測。

1.2.2Caspase-3活性檢測將各組細胞收集到離心管中，1 500 r/min、4 ℃離心5 min，收集細胞，棄去上清，PBS 洗滌1次，離心，再次吸盡上清，加入50 μL裂解液，重懸沉淀，混勻，冰裂解15 min。4 ℃、13 500 r/min離心15 min。將上清轉移至冰浴預冷的1.5 mL離心管中。立即按Caspase-3活性檢測試劑盒說明書測定Caspase-3酶活性，同時取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度。

1.2.3Western blot分析蛋白質的提取PBS漂洗各組細胞2次，4 ℃、5 000 r/min離心10 min。收集細胞，加入裂解液80 μL (RIPA∶蛋白酶抑制劑=1∶100)，冰上超聲(60 Hz)打碎，10 min/次，13 500 r/min離心15 min吸上清。BCA法測蛋白濃度。80 μg總蛋白質濃度在8%～10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移至NC膜，然后將膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h后，PBS沖洗。加入Bcl-2、Bax一抗(1∶1 000)、p53 (1∶500) 4 ℃過夜。用PBS-T緩沖液洗膜3次，15 min/次，然后用紅外熒光標記二抗(1∶10 000)對膜室溫孵育1 h后，用PBS-T沖洗NC膜3次，10 min/次。利用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對膜上蛋白進行檢測。

1.2.4Real-time PCR所有RNA均來自于肝細胞癌HepG-2細胞，采用Trizol試劑提取總RNA(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，CA，USA)，根據說明書，取約1 μg，用于合成cDNA。通過熒光定量PCR TP73-AS1 lncRNA表達水平(ABI 7500fast系統(tǒng)，應用生物系統(tǒng)，CA，USA)，以GAPDH作為內對照。RT-PCR結果顯示，相對于lncRNA TP73-AS1和GAPDH的表達，正向和反向引物序列l(wèi)ncRNA TP73-AS1：5′CCGGTTTTCCAGTTCT TGCAC 3′，5′GCCTCACAGGGAAACTTCATGC 3′；GAPDH：5′TCTACATGTTCCAGTATGACTC 3′，5′ACTCCACGACATACTCAGCACC 3′。

1.3肝癌測序數據來源從TCGA數據庫中下載肝癌的外顯子數據，整理并建立樣本與基因組成的矩陣模式的表達譜，包括250個癌癥樣本、50個正常樣本。計算lncRNA、gene的表達水平。

1.4識別顯著共表達lncRNA-gene關系對計算表達譜上任意lncRNA與任意gene表達的皮爾森相關系數(PCC)，隨機擾動gene、lncRNA標簽100次，重新計算PCC，尋找出顯著相關的lncRNA-gene關系對(PCC>0.7且P<0.01)。

1.5從表達譜提取差異表達lncRNA利用R語言程序包EdgeR計算lncRNA的差異表達值，以|log2(FoldChange)|>1且EdgeR的FDR<0.25為閾值，獲取差異表達的lncRNA。

1.6識別肝癌相關lncRNA及其下游調控通路將以上差異表達lncRNA映射到網絡中，其中度最大的lncRNA被認為是肝癌相關的lncRNA，并進行試驗驗證。將與此lncRNA共表達的mRNA進行KEGG通路映射，尋找下游潛在通路。

2　結果

2.1lncRNA TP73-AS1在肝細胞癌中高表達構建肝癌相關lncRNA-mRNA共表達網絡。其中包含25 439對顯著的lncRNA-mRNA關系。共獲取305個差異表達lncRNA，將其映射到上述共表達網絡中，映射出22個差異的lncRNA，其中TP73-AS1映射度最高，在網絡中與62個基因有顯著的PCC。將lncRNA的62個互作基因作KEGG pathway map，結果viral carcinogenesis pathway(病毒致癌作用)被映射出來。TP73-AS1潛在調控了下游基因CREBBP，且CREBBP能影響下游p53信號通路(見圖1)，因此，高表達的TP73-AS1可能通過調控p53基因起到抑制癌癥的作用。

圖1　lncRNA TP73-AS1與其潛在調控下游通路

2.2lncRNA TP73-AS1-siRNA對肝細胞癌HepG-2細胞存活率的影響為了驗證TP73-AS1是否參與HepG-2凋亡過程，首先通過MTT和AO/EB對其細胞活力及細胞形態(tài)進行檢測。將TP73-AS1-siRNA轉染到HepG-2細胞中，作用48 h后，結果顯示，與對照組相比，HepG-2的生長受到抑制(P<0.05)。同時，AO/EB結果顯示，HepG-2細胞發(fā)生凋亡。見圖2。

圖2　TP73-AS1-siRNA對HepG-2細胞活性的改變(n=3)

2.3lncRNATP73-AS1-siRNA對于肝細胞癌HepG-2細胞凋亡通路的影響為了進一步驗證TP73-AS1是否通過p53誘導HepG-2細胞凋亡，應用Western blot方法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax，同時檢測p53蛋白的變化。結果顯示，與Control相比，TP73-AS1-siRNA作用48 h后，HepG-2細胞中Bax蛋白表達顯著上調(n=3，P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達顯著下調(n=3，P<0.05)，見圖3(A)；p53蛋白表達與Control相比明顯上調(n=3，P<0.05)，見圖3(B)；與Control相比，Caspase-3活性顯著增加(n=3，P<0.05)，見圖3(C)。

3　討論

本文利用生物信息學方法來識別肝細胞癌相關的lncRNA，首先通過處理高通量測序數據來識別差異表達的lncRNA。同時構建肝癌相關lncRNA-mRNA共表達網絡，并將差異表達的lncRNA映射到該共表達網絡中。共有22個差異表達的lncRNA被映射到該網絡中，其中度(連接mRNA個數)最多的節(jié)點為TP73-AS1。我們認為，該lncRNA為肝癌相關的lncRNA。因為它不僅僅是差異表達的lncRNA，而且潛在的調控對象最多，可能廣泛參與了肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的各個通路過程。此外，我們發(fā)現TP73-AS1可能調控基因CREBBP，而該基因的下游通路為p53信號通路。

圖3　TP73-AS1-siRNA對Bax、Bcl-2 (A)及p53 (B)蛋白的影響，及其Caspase-3活性改變(n=3)

為了驗證TP73-AS1是否通過p53信號通路參與了HepG-2細胞的凋亡，本研究檢測了Bcl-2、Bax、p53蛋白的變化，以及Caspase-3活性。結果顯示，與對照組比較，TP73-AS1-siRNA能夠增加Bax/Bcl-2的比值[16]，而加入TP73-AS1-siRNA作用后，檢測Caspase-3活性，發(fā)現其活性增加。因此，本研究結果表明，TP73-AS1是通過激活Caspase-3，進而激活p53蛋白，參與HepG-2細胞凋亡過程，為lncRNA對于肝細胞癌的治療提供了理論依據，同時為臨床中肝癌的治療提供了新的方法和思路。

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Effect of long non-coding RNA TP73-AS1 on the cell apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG-2 cells and its mechanism

ZHANG Hui-rui,JIAO Jun-dong*

(Medical Department,The Second Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150080,China)

ObjectiveTo explore the expression profile of long non-coding RNA (lncRNA) TP73-AS1 in hepatocellular carcinoma,and observe the effect and mechanism of lncRNA TP73-AS1 on the apoptosis of cells of hepatocellular carcinoma.MethodsThe RNASEQ data was downloaded and processed from TCGA database,and significant hepatocellular carcinoma-related co-expression network of lncRNA and mRNA was obtained by using biochemical informatics method.The hepatocellular carcinoma-associated lncRNA TP73-AS1 was identified first.The function was evaluated by MTT,AO/EB and Western Blot.ResultsThere were 25 439 pairs of co-expression of lncRNA-gene,and 22 different lncRNAs were mapped,in which TP73-AS1 was the highest,whose interaction gene (n=62) was mapped to viral carcinogenesis pathway and affected the downstream MAPK pathway and p53 pathway.lncRNA TP73-AS1-siRNA affected the proliferation of HepG-2,up-regulated the expression of Bax,increased the activity of Caspase-3,down-regulated the expression of Bcl-2 and increased the expression of p53.ConclusionlncRNA TP73-AS1 regulates the apoptosis of cells of hepatocellular carcinoma,and it may be a novel prognostic biomarker that could serve as a potential therapeutic target in the treatment of hepatocellular carcinoma.

Long non-coding RNA;Co-expression network;Hepatocellular carcinoma;Apoptosis

2016-02-03

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)務科，哈爾濱 150080

10.14053/j.cnki.ppcr.201608002