楊長紹，徐文漭，馮　強(qiáng)，王媛媛，潘鑫艷，王　力，楊舉倫，王　麗

云南不同地區(qū)非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變檢測分析

楊長紹，徐文漭，馮強(qiáng)，王媛媛，潘鑫艷，王力，楊舉倫，王麗

目的探討云南不同地區(qū)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的表皮因子生長受體(EGFR)基因突變情況。方法收集2012 年5月～2015年1月本院云南不同地區(qū)NSCLC患者手術(shù)標(biāo)本250例，其中昆明86例，宣威81例，其他地區(qū)83例。運(yùn)用ARMS-Taqman探針法檢測標(biāo)本中EGFR基因突變情況。結(jié)果昆明地區(qū)86例中，48例 (55.8%)存在EGFR基因突變，其中19Del、L858R占總突變的81.3%（39/48），有4例同時(shí)存在19Del、L858R突變；宣威地區(qū)81例中，43例(53.1%)存在EGFR基因的突變，其中19Del占總突變的14.0%（6/43），L858R占總突變的34.9%（15/43），G719X及S768I占總突變的41.9%（18/43），有4例同時(shí)存在G719X、S768I雙突變；其他地區(qū)83例中，40例(48.2%)存在EGFR基因的突變，其中19Del、L858R占總突變的77.5% （31/40）。結(jié)論云南大部分地區(qū)EGFR基因突變情況與國內(nèi)報(bào)道一致，主要以EGFR基因19Del及L858R突變?yōu)橹鳎欢貐^(qū)NSCLC患者中，EGFR基因突變主要以L858R為主，19Del的突變低于云南其他地區(qū)，S768I則明顯高于云南其他地區(qū)。

非小細(xì)胞肺癌；EGFR基因；基因突變；云南

肺癌是目前常見的惡性腫瘤之一，全球每年因肺癌死亡的人數(shù)超過100萬，其中NSCLC最常見，約占全部肺癌的80%～90%[1]。在我國，肺癌已成為惡性腫瘤第一死因，而云南省的肺癌發(fā)病率與死亡率一直在國內(nèi)位居榜首。許多研究發(fā)現(xiàn)，表皮因子生長受體 （epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變與 EGFR絡(luò)氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）的藥物治療靶點(diǎn)相關(guān)，并已被研究及廣泛應(yīng)用于臨床。但由于地區(qū)的差異性，可能導(dǎo)致不同地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變存在差異。本研究就云南不同地區(qū)NSCLC者的EGFR基因突變情況進(jìn)行檢測分析。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源收集2012年5月～2015年1月本院云南不同地區(qū)NSCLC患者手術(shù)標(biāo)本250例，其中宣威地區(qū)81例，昆明地區(qū)86例，其他地區(qū)83例。所有標(biāo)本均經(jīng)過10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，NSCLC病理診斷明確，每例標(biāo)本均含足夠腫瘤病變組織進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2樣本DNA提取用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒 （QIAGEN公司）提取標(biāo)本塊中基因組DNA，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，所提的DNA均保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3ARMS-Taqman探針法檢測

1.3.1加樣上機(jī)從人EGFR基因突變檢測試劑盒(北京雅康博生物科技有限公司)取出已預(yù)分裝的八連管，在冰上融化后短暫離心，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。熒光信號收集時(shí)設(shè)定為FAM、HEX熒光信號，在60℃設(shè)置熒光信號收集。

1.3.2結(jié)果判斷根據(jù)人EGFR基因突變檢測試劑盒說明書，陽性、陰性對照及FAM、HEX滿足要求則繼續(xù)分析樣品的突變情況。

1.4直接測序法從250例標(biāo)本中隨機(jī)選取40例標(biāo)本，用直接測序法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間基因突變風(fēng)險(xiǎn)使用相對危險(xiǎn)度（relative risk，RR）比較，RR＜1、P≤0.05，表示該組基因突變風(fēng)險(xiǎn)偏低；RR＞1、P≤0.05，表示該組基因突變風(fēng)險(xiǎn)偏高。

2　結(jié)果

2.1云南不同地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變分布本組250例標(biāo)本中，131例 （52.4%）EGFR基因發(fā)生突變，不同地區(qū)EGFR基因突變率在33.3%～66.7%（表1）。

表1　云南不同地區(qū)EGFR基因突變情況［n（％）］????????? ???　n 　????　???? ????　????　??????????　?????????? ???　???　?? ???????　?????????? !"?　???　??????????　?? ??????? #$?　???　??????????　??????? ?? %&?　???　??????????　?????????? ’(?　???　??????????　?????????? )*?　 ??　?? ???????　?? ???? ?? +,?　???　??????????　?????????? -.?　???　??????????　?????????? /??　???　??????????　?????????? 01?　 ??　?? ???????　?????????? 23?　???　??????????　?????????? 45?　???　??????????　??????????

表2　云南不同地區(qū)NSCLC患者EGFR基因各外顯子突變比較［n（％）］?????n?????　?????????????????????? ?????　???　????????　???　???　??????　???　??? n 　???　???　???　?　?　?　?　?　? ??????　????? ???　??? !??　???!? "??　" ???　" ???　" ##?　" "#?　" $??　" "?? ?????%&???’?　!?! ???　"?" "??　"?" "??　? ???　" ?!?　" ???　" ???　$ ?"?　" !"? (???)?　??? ???　!?! ???　$?? "??　$ ?"?　" $??　" ?!?　" ?"?　? $$?　" ?#? &???’?　???$" ???????? ???　?#?#$ ???　? !#?　" #??　" ???　" ?"?　?? ???　" "$? *???+?　"?" "??　?"??$ #??　??$ ???　" #$?　" !??　$? !??　" "#?　$ ?"?　" !"? *???+%(???)?　??? $??　!?! ???　$?? "??　" !??　" ???　! !$?　" ???　" ???　" ??? ,??"-?　??? $??　$?$ ???　#?? ???　" #??　" #$?　$ ???　" ?!?　$ "??　" ??? ,??"-%&???’?　$?$ #??　$?$ ???　??$ ???　? ???　" ???　? "??　" ???　" $??　" "??

2.2云南不同地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變比較從表2可見，昆明地區(qū)86例中，48例(55.8%)存在EGFR基因的突變，其中19Del、L858R占總突變的81.3%（39/48）；其他地區(qū)83例中，40例(48.2%)存在EGFR基因的突變，其中19Del、L858R占總突變的77.5%（31/40），各外顯子均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

宣威地區(qū)81例中，43例(53.1%)存在EGFR基因的突變，其中19Del占總突變的14.0%（6/43），昆明地區(qū)EGFR基因19Del占總突變的35.4%（17/48），兩地區(qū)基因突變風(fēng)險(xiǎn)RR＜1，表示宣威地區(qū)EGFR基因19Del基因突變風(fēng)險(xiǎn)低于昆明地區(qū)（P=0.003）。宣威地區(qū)S768I占總突變的23.3%（10/43），昆明地區(qū)EGFR基因S768I無獨(dú)立突變，宣威地區(qū)S768I基因突變風(fēng)險(xiǎn)約是昆明地區(qū)的25倍（P=0.003），存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其余各外顯子均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

宣威地區(qū)與除昆明外的其他地區(qū)比較，EGFR基因19Del基因突變風(fēng)險(xiǎn)RR＜1（P＜0.05），表明宣威地區(qū)基因突變風(fēng)險(xiǎn)低于其他地區(qū)；而S768I基因突變風(fēng)險(xiǎn) RR＞1（P＜0.05），表明宣威地區(qū)S768I基因突變風(fēng)險(xiǎn)高于其他地區(qū)（約12倍）；其余各外顯子均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3直接測序法與ARMS-Taqman探針法檢測結(jié)果對比從250例標(biāo)本中隨機(jī)選取40例，用直接測序法進(jìn)行驗(yàn)證，其中1例標(biāo)本ARMS-Taqman探針法檢測EGFR基因突變陰性（圖1），用直接測序法驗(yàn)證該例EGFR基因20號外顯子第787密碼子（CAG>CAA）同義突變（圖2），但未造成氨基酸改變，結(jié)果為陰性。其余標(biāo)本直接測序法與ARMSTaqman探針法結(jié)果一致。

3　討論

EGFR基因位于人第7號染色體p13～q22區(qū)域，全長約20萬個(gè)堿基，共有28個(gè)外顯子，分別編碼胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)3個(gè)部分總共1186個(gè)氨基酸，其糖基化蛋白的分子量約為170 kDa[2-3]，胞內(nèi)區(qū)具有絡(luò)氨酸激酶活性，負(fù)責(zé)將胞外信號傳遞到胞內(nèi)。異常的EGFR活化能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、分化、血管新生，并且能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[4]。其中EGFR基因突變主要發(fā)生在第18～21號外顯子上[5]。大量研究表明[6-9]，EGFR基因18、19、21號外顯子發(fā)生突變的NSCLC患者服用EGFRTKI類藥物的療效較好，因此，在選擇靶向藥物治療之前進(jìn)行EGFR基因突變檢測尤為重要。

目前，EGFR檢測的方法很多，本研究采用ARMS-Taqman探針法檢測EGFR基因突變狀態(tài)，并隨機(jī)選取40例標(biāo)本，用直接測序法進(jìn)行比對，驗(yàn)證其結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明ARMS-Taqman探針法檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可信。直接測序法是最直接、可檢測已知和未知突變的一種方法，也是目前廣泛應(yīng)用的EGFR基因突變檢測法[10]。但由于該方法靈敏度相對較低，對于樣本量較少的標(biāo)本，如穿刺、內(nèi)窺鏡活檢小標(biāo)本，可能不能敏感地檢測出突變。而ARMSTaqman探針法檢測靈敏度比直接測序法高，檢測周期短，可以對穿刺標(biāo)本及細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行檢測，且擴(kuò)增時(shí)閉管操作的特點(diǎn)，極大程度避免了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，易于在臨床樣品中檢測開展。

在中國EGFR基因的突變存在顯著的地域差異，文獻(xiàn)報(bào)道[11-14]，臺灣地區(qū)的EGFR基因的突變以外顯子21為主，云南和廣東地區(qū)以外顯子19為主。本研究結(jié)果顯示，云南大部分地區(qū)NSCLC患者中，EGFR基因的突變主要發(fā)生在19號外顯子缺失及21號外顯子L858R突變，與報(bào)道一致。而宣威地區(qū)NSCLC患者中，EGFR基因主要以L858R突變?yōu)橹鳎?9Del的突變低于云南其他地區(qū)，S768I則明顯高于云南其他地區(qū)，與國內(nèi)報(bào)道存在一定差異。昆明地區(qū)NSCLC患者EGFR 18號外顯子G719X占總突變的10.4%（5/48）；宣威地區(qū)EGFR 18號外顯子G719X占總突變的18.6%（8/43），其中4例同時(shí)存在S768I、G719X雙突變；其他地區(qū)EGFR 18號外顯子G719X占總突變10.0%（4/40），其中2例同時(shí)存在S768I、G719X雙突變，比文獻(xiàn)報(bào)道[15]EGFR 18號外顯子上發(fā)生G719X點(diǎn)突變約占EGFR突變類型的4%高。EGFR基因第20號外顯子S768I在昆明及其他地區(qū)突變率較低，而宣威地區(qū)S768I突變率達(dá)到23.3%（10/43），其中S768I、G719X雙突變占9.3%（4/43），遠(yuǎn)高出報(bào)道的1%及2%[16]。

宣威地區(qū)肺癌患者EGFR基因突變與其他地區(qū)差異，究竟反映了發(fā)病機(jī)理的不同，飲食習(xí)慣，燃煤因素，還是遺傳學(xué)背景的區(qū)別，值得深入細(xì)致的研究。

圖1　ARMS-Taqman探針法檢測EGFR基因突變

圖2　直接測序法驗(yàn)證EGFR

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EGFR gene mutation of non-small cell lung cancer from different regions of Yunnan province

Yang Changshao,Xu Wenmang,Feng Qiang,Wang Yuanyuan,Pan Xinyan,Wang Li,Yang Julun,Wang LiDepartment of Pathology,Kunming Generalhospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China

ObjectiveTo investigate the epidermal growth factor receptor(EGFR)gene mutation of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)from different regions of Yunnan.Methods250 operative specimens of patients with NSCLC who were from different areas of Yunnan andhospitalized between May 2012 and January 2015 were collected,in which there were 86 cases from Kunming city,81 ones from Xuanwei city,and 83 ones from other regions.ARMS-Taqman probe method was used to detect the EGFR gene mutation in those specimens.ResultsAmong the 86 cases from Kunming,there were 48 ones(55.8%)of EGFR gene mutation, in which 19Del or L858R accounted for 81.3%of the total mutation(39/48).19Del and L858R existed at the same time in 4 cases. Among the 81 cases from Xuanwei,there were 43 cases(53.1%)of EGFR gene mutation,in which 19Del,L858R,and G719X or S768I accounted for 14.0%(6/43),34.9%(15/43),and 41.9%(18/43),respectively.Double mutation of G719X and S768I existed in 4 cases.Among the 83 cases from other regions,there were 40 cases(48.2%)of EGFR gene mutation,in which 19Del or L858R accounted for 77.5%(31/40).ConclusionThe situation of EGFR mutation in most regions of Yunnan is the same as that reported in our country,in which 19Del and L858R are the predominant gene.Among the NSCLC patients from Xuanwei,L858R is the main gene mutation.Their proportion of 19Del is lower than that of patients from other regions of Yunnan,but the proportion of S768I is significantlyhigher than that of patients from other regions.

non-small cell lung cancers;EGFR gene;gene mutation detection;Yunnan

R 734.2

A

1004-0188（2016）01-0004-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.01.002

國家自然科學(xué)基金青年基金（81201759）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目（2012FB210）

650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院病理科

王麗，電話：0871-64774212;E-mail：2001wl@163.com

（2015-11-17）