秦智偉，郭　磊，周秀艷，辛　明（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱　150030）

黃瓜低霜霉威殘留性相關(guān)基因SDH克隆及表達

秦智偉，郭磊，周秀艷，辛明
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱150030）

通過Solexa技術(shù)和比較基因組學(xué)方法鑒定霜霉威脅迫下黃瓜果實差異表達基因，篩選黃瓜低霜霉威殘留性相關(guān)基因SDH。研究利用PCR克隆獲得SDH基因全長，命名為CsSDH。構(gòu)建亞細胞定位表達載體，利用農(nóng)桿菌浸潤法注射煙草葉片后激光共聚焦顯微鏡下觀察；分別用熒光定量RT-PCR方法和酶聯(lián)免疫法研究高、低農(nóng)殘品系D9320和D0351中CsSDH基因在農(nóng)藥霜霉威處理后，不同時間點、不同組織部位時空表達特征和琥珀酸脫氫酶活性。結(jié)果表明，CsSDH基因在煙草葉片細胞中被定位在細胞膜上。黃瓜低農(nóng)殘品種D0351中，CsSDH基因在果實受霜霉威脅迫后反應(yīng)迅速，主要在處理前期響應(yīng)表達強烈，琥珀酸脫氫酶活性顯著增加，且該基因表達量顯著高于其在高農(nóng)殘品種D9320中表達量。CsSDH果、葉中表達量較莖中高，且各組織部位表達量高低順序穩(wěn)定，為葉>果>莖。黃瓜高農(nóng)殘品種D9320中，CsSDH基因表達量在0.5、1、3、12 h呈現(xiàn)上調(diào)表達，6、9 h基因表達量差異不顯著，48 h出現(xiàn)上調(diào)表達高峰。說明克隆得到的CsSDH基因?qū)俎r(nóng)藥處理前期響應(yīng)基因，且該基因可能在降低黃瓜農(nóng)藥殘留過程中發(fā)揮重要作用。試驗通過研究黃瓜琥珀酸脫氫酶基因（SDH）在霜霉威脅迫下表達情況，為挖掘黃瓜低農(nóng)藥殘留性功能基因以及探明其作用分子機制奠定基礎(chǔ)。

黃瓜；琥珀酸脫氫酶；基因克?。粊喖毎ㄎ?；基因表達

秦智偉,郭磊,周秀艷,等.黃瓜低霜霉威殘留性相關(guān)基因SDH克隆及表達[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(4):24-33.

Qin Zhiwei,Guo Lei,Zhou Xiuyan,et al.Cloning and expression of theSDHgene related to the cucumber propamocarb's residual property[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(4):24-33.(in Chinese with English abstract)

網(wǎng)絡(luò)出版時間2016-4-22 10:01:20[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160422.1001.022.html

農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留是影響食品安全的重要因素?；瘜W(xué)農(nóng)藥自1938年在世界推廣應(yīng)用以來，20世紀50年代末農(nóng)藥殘留問題凸現(xiàn)，蔬菜農(nóng)藥殘留問題現(xiàn)已成為政府、市場和消費者關(guān)注的熱點問題[1]。殘留農(nóng)藥直接或間接傳遞給人、畜，并在人、畜體內(nèi)富集，不僅造成生物體慢性中毒，有的農(nóng)藥還有致DNA損傷、致畸和致癌作用[2-3]。目前，從生物遺傳育種角度探索降低農(nóng)藥殘留機理，依靠生物體自身特性解決農(nóng)藥殘留問題，培育低農(nóng)殘新品種，已成為解決蔬菜農(nóng)殘問題重要途徑。

琥珀酸脫氫酶從釀酒酵母中首次提取克隆與鑒定，屬黃素酶類[4]。也稱為線粒體復(fù)合物Ⅱ，由A、B、C、D 4個亞基組成的異源四聚體，分別由相應(yīng)核基因編碼[5]。SDH是三羧酸循環(huán)和線粒體呼吸鏈組成部分，在細胞能量代謝中起重要作用。SDH在氧化磷酸化過程中，可催化琥珀酸產(chǎn)生延胡索酸，并將FAD還原成FADH2，通過TCA循環(huán)將糖分解為二氧化碳和水，生物體內(nèi)大部分ATP均由此途徑產(chǎn)生[6-7]。TCA途徑是植物體能量代謝主要途徑，為植物體提供能量和代謝合成原料。SDH是目前評定機體有氧代謝供能能力重要指標[8]。近年來，國內(nèi)外對該基因在植物應(yīng)用方面研究較少。張宇君等研究表明，病原菌編碼琥珀酸脫氫酶基因不但與抗藥性基因表達有關(guān)外，還與病原菌致病性基因表達密切相關(guān)[9]。在整個電子傳遞鏈上傳遞大量電子時，有些電子漏出，使氧氣發(fā)生電子還原而產(chǎn)生超氧陰離子自由基[10]。Rothery等研究表明，定點突變的琥珀酸脫氫酶可提高超氧陰離子自由基產(chǎn)量，使生物體生物膜結(jié)構(gòu)及功能受損傷，引起核酸及蛋白質(zhì)變性等，對細胞及組織產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)[11]。Popov等研究發(fā)現(xiàn)，琥珀酸脫氫酶活性及mRNA含量受光及光敏色素調(diào)控[12]。Gleason等提供遺傳證據(jù)表明，線粒體復(fù)合物II的電子傳遞鏈，有助于植物體局部修復(fù)，且在植物脅迫基因表達調(diào)控和防御反應(yīng)中具有重要作用[13]。

蔬菜農(nóng)藥殘留問題研究主要集中在農(nóng)殘對植物生理機制影響和農(nóng)殘檢測技術(shù)方面[14]，去除殘留農(nóng)藥方法也主要以降解果蔬外農(nóng)藥殘留為主[15]。馬佰慧對黃瓜果實霜霉威殘留性進行遺傳分析，提出黃瓜果實中霜霉威殘留性符合加性-顯性遺傳模型，受環(huán)境影響不大，是多基因控制的數(shù)量性狀，同時檢測到1個與霜霉威殘留性相關(guān)的QTL位點，這個QTL位點距離最近標記圖距為6.3 cM[16]。本課題組已從黃瓜種質(zhì)資源中篩選出霜霉威殘留量不同的黃瓜品種（品系）[16-18]，并發(fā)掘參與霜霉威脅迫響應(yīng)的蛋白和基因[19-20]。

基于吳鵬等Solexa高通量測序分析基礎(chǔ)[20]，通過對CsSDH基因克隆和序列及表達模式分析，擬探明該基因響應(yīng)霜霉威脅迫規(guī)律，為黃瓜低霜霉威殘留性分子機制研究奠定基礎(chǔ)，同時為低農(nóng)藥殘留黃瓜新品種選育提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料

以黃瓜“D0351”（低農(nóng)殘品系）和“D9320”（高農(nóng)殘品系）為試驗材料[17]，種子由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供。

2015年4月中旬于溫室內(nèi)播種育苗，植株生長到兩葉一心時定植于塑料棚內(nèi)，正常田間管理，于定植后34 d（第10節(jié)位瓜商品成熟）全株噴施霜霉威處理，噴施劑量為400倍霜霉威鹽酸鹽水劑，以同時間噴水處理為對照，噴施到葉面和果實開始滴液程度時停止噴施。地面覆蓋農(nóng)膜，防止農(nóng)藥浸入土壤。于處理后0.5、1、3、6、9、12、24和48 h取黃瓜植株第10節(jié)位葉、莖、果實，并選取3株長勢一致黃瓜植株混合取樣。迅速凍于液氮，-80℃保存?zhèn)溆?。田間種植在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝中心完成。

1.1.2酶及生化試劑

TaqDNA聚合酶，DNAmarker，限制性內(nèi)切酶HindⅢ、Bam HⅠ，T4DNA連接酶，質(zhì)粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，SYBR qP?CRmix，ReverTra Ace qPCR RT Kit（東洋紡）購自大連賽拓生物技術(shù)有限公司，凝膠回收試劑盒購自百泰克，植物琥珀酸脫氫酶活性檢測試劑盒（ml?bio）購自上海盈公實業(yè)有限公司，引物合成及菌液測序均由上海生物工程技術(shù)有限公司完成。其編號及序列見表1。

表1　引物序列及用途Table 1　Sequence and usage of primers

1.1.3克隆菌株及載體

pEASY-T3 Cloning Kit，DH5α感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，農(nóng)桿菌LBA4404、PBI121載體及亞細胞定位載體eGFP均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組保存。

1.2方法

1.2.1總RNA提取與cDNA合成

按照Trizol試劑（Invetrition）說明書提取黃瓜葉片總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和SMA 3000檢測其完整性和濃度。利用ReverTra Ace qPCR RT Kit （TOYOBO）說明書合成cDNA，樣品稀釋至200 ng·μL-1，-20℃保存，備用。

1.2.2CsSDH基因克隆

利用Premier 5.0軟件，根據(jù)Solexa測序差異序列比對出黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫中Csa3M595230.2基因序列編碼區(qū)設(shè)計引物并合成[20]。反應(yīng)體系為cDNA 2.0 μL、dNTP（2.5mmol·L-1）2.0 μL、上下游引物（10mmol·L-1）各 0.5 μL、Buffer（10×）2 μL、Easy Taq酶0.2 μL和ddH2O 12.8 μL。95℃預(yù)變性5min；95℃變性30 s，62℃復(fù)性30 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)；72℃10min，4℃終止反應(yīng)。將克隆獲得產(chǎn)物切膠回收，與pEASY-T3載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α，37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆，經(jīng)菌體PCR驗證正確后送金唯智（上海）股份有限公司測序。

1.2.3生物信息學(xué)分析

由核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫上用BLASTp分析序列相似性?；蜷_放閱讀框用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）的ORF Finder分析；利用protparam（http://web.ex?pasy.org/protparam/）分析編碼蛋白氨基酸組成、理論分子質(zhì)量和等電點；并通過NCBI（http://www.nc?bi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析基因保守結(jié)構(gòu)域；應(yīng)用ProtScal（http://www.expasy.ch/cgibin/protscale.pl）軟件預(yù)測蛋白質(zhì)疏水性；應(yīng)用TMHMM Server V.2.0在線程序預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用TargetP 1.1 Server預(yù)測和分析氨基酸序列導(dǎo)肽；二級結(jié)構(gòu)分析采用PredictProtein（http:// www.predictprotein.org/）分析，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index）；使用ClustaW軟件多重序列比對；利用Mega5軟件，采取Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹并分析[21]。

1.2.4不同品種、組織、時間點基因表達量分析

分別提取混合樣品總RNA，方法同1.2.1。cDNA 第1鏈合成參考反轉(zhuǎn)錄說明書（TOYOBO）。將合成的cDNA稀釋至200 ng·L-1后，于-20℃保存，用于熒光定量RT-PCR分析試驗。利用網(wǎng)站（https://www. genscript.com/ssl-bin/app/primer）設(shè)計熒光定量引物CsSDH-qF和CsSDH-qR，以EF1a（Elongation Fac?tor 1a）為內(nèi)參基因，設(shè)計特異PCR引物、EF1a-F、EF1a-R，qRT-PCR反應(yīng)體系為cDNA2 μL，上下游引物分別為0.5 μL（10mmol·L-1），SYBR Green PCRmastermix 10 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 3min；95℃變性10 s，55℃ 30 s，72℃30 s，40個循環(huán)。樣品和內(nèi)參分別設(shè)3次重復(fù)。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0和2-ΔΔCt方法分析。

1.2.5CsSDH基因編碼蛋白的亞細胞定位

設(shè)計亞細胞定位引物CsSDH-YF和CsSDHYR，以cDNA為模板，克隆目的基因，反應(yīng)體系及程序同1.2.2，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收目的片段T/A克隆后測序。從測序正確菌液中提取質(zhì)粒，再分別HindⅢ和Bam HⅠ雙酶切，T4DNA連接酶連接到eGFP載體上，獲得GFP/目的基因的融合表達載體。然后再轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞、PCR擴增、酶切篩選陽性克隆，并對陽性克隆測序驗證。將測序正確質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，卡那霉素和利福平雙抗性篩選含有功能質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。將含有功能質(zhì)粒的農(nóng)桿菌28℃培養(yǎng)至OD600=0.3，等體積buffer（10mmol·L-1MES, 200 μmol·L-1acetosyringone，10mmol·L-1MgCl2）懸浮，并室溫靜置4～6 h，然后由下表皮注射到生長4周煙草葉片中，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 d，以不連接目的基因空載體eGFP（編碼綠色熒光蛋白GFP）為陽性對照。用激光共聚焦顯微鏡直接觀察葉片熒光情況。

1.2.6琥珀酸脫氫酶活性測定

利用酶聯(lián)免疫法琥珀酸脫氫酶活性檢測試劑盒（mlbio）檢測霜霉威處理不同品種、組織及時間點琥珀酸脫氫酶活性。

2　結(jié)果與分析

2.1CsSDH基因克隆

通過在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.icugi.org/）中比對，找到基因ID為Csa3M595230.2的基因編碼區(qū)全序列，使用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0設(shè)計引物SDH-F、SDH-R，以黃瓜D0351幼葉器官來源cDNA為模板，經(jīng)克隆測序得SDH全長，命名為CsSDH，獲得長度為834 bp全長ORF（見圖1）。

圖1　CsSDH的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1　PCR products of CsSDH

2.2CsSDH生物信息學(xué)分析

2.2.1氨基酸序列及理化性質(zhì)

將序列經(jīng)NCBI上的ORF finder程序分析，得到ORF閱讀框長為834 bp。該蛋白由20種氨基酸組成，包含277個氨基酸，分子質(zhì)量為31 035.7，理論等電點為8.87。正電殘基（Asp+Glu）為29，負電殘基（Arg+Lys）為38。原子組成為1 361個C、2 176個H、386個N、403個O、20個S，化學(xué)式是C1361H2176N386O403S20，原子總數(shù)4 346個。該蛋白總平均親水性（Grand average of hydropathI city，GRA?VY）、不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）、脂肪系數(shù)（AlIphatic index）分別為-0.377、64.56、81.08，是一個不穩(wěn)定蛋白，無信號肽。由TMHMM Server V.2.0在線程序預(yù)測CsSDH編碼蛋白無跨膜區(qū)域，為非跨膜蛋白。

2.2.2CsSDH功能結(jié)構(gòu)域分析

通過NCBI保守域結(jié)構(gòu)分析程序?qū)sSDH進行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，CsSDH基因推導(dǎo)的氨基酸序列包含2個結(jié)構(gòu)域，在48-152aa具有Fer_2保守結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域?qū)儆贔er2超家族，在酶促反應(yīng)和電子傳遞過程中起重要作用。而靠近C-端189-262 aa具有1個 Fer4_17結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域?qū)勹F硫蛋白超家族（HCP-like superfamily），在氮代謝中發(fā)揮重要作用。

圖2　CsSDH編碼蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.2　CsSDH encoding protein domain prediction

2.2.3CsSDH二級和三維結(jié)構(gòu)分析

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，CsSDH編碼的蛋白中螺旋結(jié)構(gòu)占30.32%，肽鏈占6.86%，無規(guī)則卷曲占62.82%?？梢?，α-螺旋和無規(guī)則卷曲占據(jù)該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)大部分構(gòu)成。對CsSDH蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測（見圖3），可見，該蛋白含有多處粉紅色的α-螺旋和黃色的β-折疊。

圖3　黃瓜CsSDH三維結(jié)構(gòu)模型Fig.3　3-D structuremodels of CsSDH

2.2.4CsSDH蛋白系統(tǒng)進化樹

為研究CsSDH與其他植物琥珀酸脫氫酶基因進化關(guān)系，Clastal W對氨基酸序列比對后，利用MEGA 5.0軟件通過Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建氨基酸序列進化樹，結(jié)果顯示（見圖4），黃瓜CsSDH與甜瓜CmSDH關(guān)系最近，同源性為96%，與大豆同源性為84%，與菜豆同源性為85%，與鷹嘴豆同源性為86%，與蒺藜苜蓿同源性為84%，與番茄、馬鈴薯親緣關(guān)系較遠，同源性僅為82%。從進化樹上看，相同科或類群植物聚為一類，但不同植物間SDH間也有很高同源性，可推測其在進化過程中相當(dāng)保守。

2.3CsSDH基因不同品種、不同時間、不同組織部位表達量分析

為進一步了解該基因霜霉威脅迫下，不同黃瓜組織內(nèi)表達特性，本研究以低農(nóng)殘黃瓜品系D0351和高農(nóng)殘黃瓜品系D9320為試驗材料，利用熒光定量RT-PCR技術(shù)分析CsSDH基因在霜霉威處理后黃瓜果皮不同處理時間表達情況。結(jié)果如圖5所示，D0351黃瓜果實霜霉威處理后，CsSDH基因表達水平迅速升高，并在1 h時達到高峰，是對照的4.75倍，然后逐漸降低，到48 h到達最低，是對照的0.6倍。在0.5～48 h處理時間內(nèi)，除48 h外，其余時間點CsSDH基因表達量均高于對照組，尤其在霜霉威處理0.5、1、3、6 h處，CsSDH基因表達量均極顯著高于對照13.5～1.5倍，說明CsSDH基因在果實受霜霉威脅迫后反應(yīng)迅速，主要在處理前期響應(yīng)表達強烈。而在高農(nóng)殘品種D9320中（見圖6），CsSDH基因表達量在0.5、1、3、12 h也呈上調(diào)表達，但其表達量和表達規(guī)律與D0351表現(xiàn)不一致，特別是48 h出現(xiàn)上調(diào)表達高峰，是對照的11倍，與D0351表達規(guī)律相反。除48 h外，其余時間表達量均在1.5及以下，CsSDH基因整體表達水平低于低農(nóng)殘品種D0351表達量。由此可以看出，此基因?qū)档娃r(nóng)殘有重要作用，同時也表明，CsSDH基因是響應(yīng)霜霉威脅迫的一個應(yīng)答基因。

圖4　CsSDH系統(tǒng)進化分析Fig.4　Phylogenetic analysis of CsSDH

圖5　黃瓜CsSDH基因在低農(nóng)殘品系D0351果實中農(nóng)藥霜霉威處理后表達量Fig.5　Expression of CsSDH in low pesticide residues cucumber strain D0351 after propamocarb treatment

圖6　黃瓜CsSDH基因在高農(nóng)殘品系D9320果實中農(nóng)藥霜霉威處理后表達量Fig.6　Expression of CsSDH in high pesticide residues cucumber strain D9320 after propamocarb treatment

同樣利用qRT-PCR技術(shù)分析CsSDH基因霜霉威處理后低農(nóng)殘品系D0351果、葉、莖不同部位和不同時間點表達情況，結(jié)果見圖7。經(jīng)霜霉威處理后，CsSDH基因總體表達趨勢：果實和葉片隨處理時間延長其表達量逐漸降低，處理后3 h最高、9 h次之、24 h最低。不同部位表達量高低順序是葉> 果>莖。CsSDH基因處理后3 h果實和葉片部位表達量最高，顯著高于莖部，是莖中表達量的4倍以上。CsSDH基因在莖中的表達量3個不同處理時間段基本一致無變化，均顯著低于其在果實和葉片中表達量。說明CsSDH基因在黃瓜葉片、果實和莖部穩(wěn)定表達，該基因可能主要在葉片和果實中發(fā)揮作用。

2.4CsSDH基因編碼蛋白的亞細胞定位

為研究CsSDH編碼蛋白的亞細胞定位，將CsSDH-GFP融合表達載體轉(zhuǎn)入煙草葉片細胞中，在激光共聚焦顯微鏡下觀察CsSDH融合蛋白亞細胞定位情況。由圖8可知，綠色熒光信號主要富集于細胞膜上，該基因編碼蛋白主要定位于細胞膜上。

圖7　黃瓜CsSDH組織特異性表達Fig.7　Tissue-specific expression of CsSDH gene in fruit,stem and leaf of cucumber

圖8　黃瓜CsSDH基因亞細胞定位分析Fig.8　Subcellular localization analysis ofCsSDH

2.5琥珀酸脫氫酶活性測定

為進一步了解CsSDH基因表達在降低農(nóng)藥殘留中的作用，測定D0351和D9320果實霜霉威處理后琥珀酸脫氫酶活性。結(jié)果表明（見圖9），隨霜霉威處理后時間增加，低殘留品系D0351琥珀酸脫氫酶活性呈先降后升趨勢，且整體酶活性均高于其他組。且其對照組中琥珀酸脫氫酶活性也高于D9320中此酶活性。而在D9320中，處理后24和48 h，琥珀酸脫氫酶活性低于其對照組，其他時間點此酶活性均高于對照組。此結(jié)果也間接驗證CsS?DH基因在降低農(nóng)藥殘留過程發(fā)揮重要作用。另外，在不同組織中，琥珀酸脫氫酶平均活性也呈葉>果>莖，這與CsSDH基因在不同組織中表達量結(jié)果一致（見圖10）。

圖9　霜霉威處理后黃瓜果實中琥珀酸脫氫酶活性變化Fig.9　Activity of succinate dehydrogenase in cucumber after propamocarb treatment

圖10　黃瓜琥珀酸脫氫酶在果、葉、莖霜霉威處理后不同時間點的表達Fig.10　Expression of CsSDH at different time points of cucumber fruit, leaf and stem after propamocarb treatment by qRT-PCR

3　討論

吳鵬等利用Solexa技術(shù)和比較基因組學(xué)方法鑒定霜霉威脅迫下黃瓜果實差異表達基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在農(nóng)藥霜霉威脅迫下，黃瓜果實差異表達的基因主要有四大類，第一類主要為農(nóng)藥解毒相關(guān)基因，包括多向耐藥性蛋白基因（PDR）、多藥耐藥性蛋白基因（MRP）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因（GST）、ABC轉(zhuǎn)動蛋白基因（ABCT）、細胞色素 P450 （CYP）、苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）等；第二類主要包括與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，涉及TCP轉(zhuǎn)錄因子、GATA轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子30、DREB1轉(zhuǎn)錄因子等；第三類主要包括轉(zhuǎn)運與信號相關(guān)基因，琥珀酸脫氫酶（SDH）、蔗糖轉(zhuǎn)動基因（SUT）、氨基轉(zhuǎn)移酶（AMT）等；第四類主要包括脅迫與刺激相關(guān)的基因，過氧化物酶基因（POD）、幾丁質(zhì)酶Ⅳ基因（CHI4）、半胱氨酸合酶（CYS、70 ku熱休克蛋白基因（HSP）等[20]。本試驗選擇第三類轉(zhuǎn)運與信號相關(guān)基因SDH展開研究。

為深入研究黃瓜中CsSDH基因具體調(diào)節(jié)機制及與低農(nóng)殘關(guān)系，本試驗利用RT-PCR技術(shù)從黃瓜品種D0351中克隆CsSDH基因，并利用生物信息學(xué)方法分析CsSDH基因編碼的蛋白可能結(jié)構(gòu)和功能。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，CsSDH氨基酸序列與甜瓜中CmSDH氨基酸進化關(guān)系最近，推測CsS?DH基因可能參與甜瓜CmSDH相似的生物化學(xué)反應(yīng)。從進化樹上看，相同科或類群的植物聚為一類，但不同植物間SDH也有很高同源性，可推測其在進化過程中相當(dāng)保守。

分析該基因在霜霉威處理后不同時間點表達發(fā)現(xiàn)，CsSDH基因在果實中受霜霉威脅迫反應(yīng)迅速，主要在處理前期響應(yīng)表達強烈，該結(jié)果與實驗室前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致[20]。而在高農(nóng)藥殘留品種D9320中（圖6），CsSDH基因表達量0.5、1、3、12 h也呈上調(diào)表達，但表達量和表達規(guī)律與D0351表現(xiàn)不一致，特別是48 h出現(xiàn)上調(diào)表達高峰，是對照的11倍。這點與D0351表達規(guī)律相反。這可能是由于霜霉威處理后，果皮中農(nóng)藥殘留量在48 h達到最大值，且高農(nóng)藥殘留品種D9320果實中的殘留量變化率大于低農(nóng)藥殘留品種[22]，因此CsSDH基因在低農(nóng)藥殘留品種D0351中表達量變化穩(wěn)定。以上結(jié)果，進一步說明CsSDH是一個響應(yīng)霜霉威信號的關(guān)鍵基因，推測該基因表達量可能受農(nóng)藥殘留量影響，在降低農(nóng)藥殘留量過程中發(fā)揮重要作用。

分析CsSDH基因在低農(nóng)殘品種D0351中果、葉、莖霜霉威處理后不同時間點表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因轉(zhuǎn)錄在果和葉中處理后3 h表達量達到最高峰，是莖中該基因表達量的4倍，該基因在莖中不同時間點表達量變化不大。處理后9 h，各器官CsSDH基因表達量均降低，處理后24 h，基因表達量繼續(xù)下降，此3個階段表達量高低順序均為葉>果>莖，說明CsSDH基因在黃瓜果、莖、葉中表達量高低順序穩(wěn)定，葉片中表達量最高，莖中最低?？赡苁怯捎谌~片和果實是黃瓜的“生產(chǎn)源”和“積累庫”，代謝網(wǎng)絡(luò)龐大而復(fù)雜，對外界刺激有積極反應(yīng)能力；莖是特化組織，功能專一，代謝相對簡單，對外源刺激不敏感。這與ABC19在霜霉威脅迫下響應(yīng)模式一致[23]。

利用酶聯(lián)免疫法測定琥珀酸脫氫酶活性。結(jié)果表明，霜霉威脅迫下，D0351中琥珀酸脫氫酶活性顯著高于對照組。且D0351中此酶活性整體高于D9320霜霉威處理組及對照組。這與該基因霜霉威脅迫下表達模式相符，與巴拉圭茶干旱脅迫下SDH基因上調(diào)表達及酶活升高結(jié)果一致[24]。

擬南芥中，琥珀酸脫氫酶的黃素蛋白亞基由兩個核基因編碼，sdh1-1和sdh1-2。Fuentes等研究發(fā)現(xiàn)，雜合子SDH1-1/SDH1-1突變體植株與野生型相比，表現(xiàn)出較高二氧化碳同化率和較高生長率[26]。這與Araújo等關(guān)于轉(zhuǎn)基因番茄的研究結(jié)果一致[25]。二氧化碳同化和氣孔導(dǎo)度之間相關(guān)性較強，且試驗證明，此突變體植株較野生型植株有更高的氣孔開度和密度。這也可合理解釋琥珀酸脫氫酶基因的過量表達，可降低氣孔開度及密度，減少農(nóng)藥從氣孔浸入機率和浸入量。Fuentes等還發(fā)現(xiàn)，SDH1-1/SDH1-1突變體幼苗在限制氮含量條件下生長很好[26]。

后續(xù)研究工作中，將檢測該基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達情況，并用霜霉威處理轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株，不同時間點取材測定組織農(nóng)藥殘留量驗證該基因功能，為深入探討CsSDH在霜霉威降解過程中作用機制奠定基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

本研究通過RT-PCR方法分離并克隆黃瓜CsSDH基因，該基因全長834 bp，編碼277個氨基酸，其編碼蛋白無信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和明顯疏水區(qū)域；采用實時熒光定量PCR方法研究高農(nóng)殘品種D9320和低農(nóng)殘品種D0351噴施霜霉威后0.5、1、3、6、9、12、24、48 h各組織基因表達量。霜霉威脅迫下，CsSDH基因低農(nóng)殘品系D0351中表達量顯著高于高農(nóng)殘品系D9320；不同組織內(nèi)表達量高低順序穩(wěn)定，為葉>果>莖；低農(nóng)殘黃瓜品種D0351，CsSDH基因霜霉威脅迫初期（3 h）表達量最高，主要在葉片和果實中表達。亞細胞定位顯示CsSDH基因編碼的蛋白位于細胞膜。

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Cloning and expression of theSDHgene related to the cucumber propamocarb's residual property

QIN Zhiwei,GUO Lei,ZHOU Xiuyan,XINming(School of Horticulture,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

Using Solexa technology,differentially expressed genes were identified under propamocarb treatment of cucumber fruit through themethod of comparative genomics,and found that theSDHgene related to the cucumber propamocarb's residual property.Obtain the full-length sequence ofSDHgene by using PCR cloning,and named asCsSDH.Construct subcellular localization expression vector and using a laser scanning confocalmicroscope to observe the tobacco leaves after injection by the way of agrobacterium infiltration;Respectively use fluorescence quantitative RT-PCR and enzymelinked immunosorbent assay to study the temporal and spatial characteristics in different tissues and at different time points after the treatment of pesticide propamocarb,and succinic dehydrogenase activity ofSDHgene in high and low agricultur-al product of D9320 and D0351.The results showed that theCsSDHgene were localized in the cellmembrane of tobacco leaf cells.In the cucumber low pesticide D0351,CsSDHgene responded rapidly after the fruit was threatened by propamocarb,this wasmainly embodied in strong response expression in the early stage of treatment and significant increase of succinate dehydrogenase activity,and the expression level was significantly higher than the expression in high agricultural residues D9320.The expression ofCsSDH in leaf and fruits was higher than that in stem,and the sequence of the expression of various tissue sites was stable,that was leaves>fruit>stem.In cucumber high agricultural residues D9320,the gene expression ofCsSDHshowed up-regulation at 0.5,1,3,12 h,the difference of gene expression was not significant at 6,9 h,while there was a rise peak of the expression at 48 h.It illustrated that the cloningCsSDHgene belonged to the response genes in the early stage of pesticide treatment,and this genemay play an important role in the process of reducing pesticide residues in cucumber.Through the analysis of the expression of cucumber succinate dehydrogenase(SDH)under the stress of propamocarb,it laid the foundation formining the functional gene of low pesticide residue in cucumber and ascertaining themolecularmechanism of its action.

cucumber;succinate dehydrogenase;gene cloning;subcellular localization;gene expression

S642.2

A

1005-9369（2016）04-0024-10

2015-12-30

國家自然科學(xué)基金項目（31272158）

秦智偉（1957-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為蔬菜遺傳育種。E-mail:qzw303@126.com