唐鑫華，姜廷波，高紅秀，王敬國，鄒德堂*（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱　50030；.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱　50040）

煙草鐵蛋白基因NtFer1對粳稻遺傳轉(zhuǎn)化及其基因功能研究

唐鑫華1，姜廷波2，高紅秀1，王敬國1，鄒德堂1*
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030；2.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150040）

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將煙草鐵蛋白基因NtFer1轉(zhuǎn)入粳稻，經(jīng)抗性篩選、PCR、Southern雜交、Northern雜交檢測。結(jié)果表明，外源基因已整合到粳稻基因組中，并能穩(wěn)定遺傳表達(dá)。過量Fe2+營養(yǎng)液條件下培育自交T1代植株，研究表明轉(zhuǎn)基因株系SOD和POD活性、葉綠素相對含量高于對照，而MDA含量則相反；轉(zhuǎn)基因株系葉片和糙米總鐵含量高于對照，所測16種氨基酸總含量與對照無顯著差異，但部分氨基酸含量存在差異；接種稻瘟病混合小種菌液轉(zhuǎn)基因株系稻瘟病葉瘟指數(shù)低于對照。煙草鐵蛋白基因NtFer1轉(zhuǎn)入表達(dá)可提高粳稻葉片和糙米儲藏鐵離子能力，增強(qiáng)對高鐵脅迫耐性和稻瘟病葉瘟抗性。

NtFer1；總鐵含量；粳稻；稻瘟病

唐鑫華,姜廷波,高紅秀,等.煙草鐵蛋白基因NtFer1對粳稻遺傳轉(zhuǎn)化及其基因功能研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(4): 73-78.

Tang Xinhua,Jiang Tingbo,Gao Hongxiu,et al.Research on gene function and japonica genetic transformation of tobacco ferritin geneNtFer1[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(4):73-78.(in Chinese with English abstract)

網(wǎng)絡(luò)出版時間2016-4-22 10:01:19[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160422.1001.020.html

鐵是植物生長必需微量元素之一，在植物葉綠體合成和酶組成中必不可少，能促進(jìn)植物光合及呼吸作用[1]；是動物體血紅蛋白重要組成元素之一，鐵攝入量不足易導(dǎo)致貧血等疾病。酸性條件下土壤會釋放大量Fe2+，造成鐵污染，而過量Fe2+將催化Fenton反應(yīng)，生成具有強(qiáng)氧化性羥自由基，對植物產(chǎn)生毒害，潛育性水稻土中Fe2+毒害是限制水稻生長原因之一[2-3]。鐵蛋白（Ferritin）是一種可儲存鐵離子的儲藏結(jié)合蛋白，由24個同源或異源亞基組成的450 ku復(fù)合體，每個鐵蛋白分子可儲藏0～4 500個可溶、無毒、可利用鐵離子；可為植物體光合作物和固氮鐵源，作為脅迫反應(yīng)蛋白，促進(jìn)過剩鐵離子儲藏[4-6]。

研究表明，煙草鐵蛋白基因NtFer1在煙草中過量表達(dá)能提高植株抗氧化能力、葉片總鐵含量和最大光化學(xué)量子產(chǎn)量[7]。將豌豆鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因植株葉片與非轉(zhuǎn)基因植株相比對氧化脅迫耐受能力有不同程度增強(qiáng)[8]；將紫花苜蓿鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草對除草劑百草枯引起的氧化脅迫抗性增強(qiáng)[9]。將豌豆鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入粳稻（秀水11），轉(zhuǎn)基因植株鐵貯藏量增加、體內(nèi)游離鐵含量降低，減輕植株氧化損傷[10]。本研究將鐵蛋白基因NtFer1轉(zhuǎn)入粳稻（東農(nóng)427），過量Fe2+脅迫條件下分析轉(zhuǎn)基因粳稻生理響應(yīng)、總鐵含量和糙米氨基酸含量等，為深入研究鐵蛋白基因功能、防止土壤中過量Fe2+對水稻毒害及作物抗逆基因工程研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)選用粳稻品種東農(nóng)427，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供。煙草鐵蛋白基因NtFer1（Gen?Bank登錄號：AB083924）為前期研究獲得，cDNA編碼區(qū)全長756 bp，編碼251個氨基酸。植物表達(dá)載體PBI121由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1載體構(gòu)建和菌株培養(yǎng)

將煙草鐵蛋白基因NtFer1 cDNA片段插入植物表達(dá)載體PBI121替代GUS基因，啟動子CaMV 35S，終止子NOS，篩選標(biāo)記NPTⅡ基因，利用凍融法將經(jīng)測序質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105。將農(nóng)桿菌EHA105-NtFer1涂布含Kan 50mg·L-1和Rif 50mg· L-1的LB固體培養(yǎng)基，27℃暗培養(yǎng)，挑取若干單菌斑至含Kan 50mg·L-1和Rif 50mg·L-1的LB液體培養(yǎng)基，27℃、160 r·min-1培養(yǎng)12～16 h，取500 μL上述菌液加入100mL YEB培養(yǎng)液中，待OD= 0.5時侵染備用。

1.2.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化

粳稻成熟種子除去穎殼，經(jīng)75%酒精60 s、0.1%HgCl210min和NaClO 20min消毒處理后，播至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，14 d剝離愈傷組織至愈傷繼帶培養(yǎng)基[11]，10 d后轉(zhuǎn)至預(yù)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)4 d，將愈傷組織浸沒于農(nóng)桿菌EHA105-NtFer1菌液中30min，置于共培養(yǎng)基20℃暗培養(yǎng)3 d，經(jīng)篩選、分化和生根培養(yǎng)將幼苗移入壯苗營養(yǎng)液中培養(yǎng)，選出長勢較好若干株自交并收獲種子，將其播種于MS培養(yǎng)基（Kan 50mg·L-1+Fe2+300 μmol·L-1）進(jìn)一步研究。

1.2.3轉(zhuǎn)基因植株分子檢測

試劑盒（原平皓，HF224）提取葉片基因組DNA。應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計特異引物，Nt?Fer1-F（5'CCA CTA TCC TTC GCA AGA CCC TTC C 3'）和NtFer1-R（5'CAT CGC AAG ACC GGC AAC AGG ATT C 3'），PCR反應(yīng)體系：模板0.5 μg，100 μmol·L-1引物各0.1 μL，10×Buffer（withmg2+）2.0 μL，2.5mmol·L-1dNTP 2 μL，5 U·μL-1Taq 0.2 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：94℃2min；94℃30 s，58.5℃30 s，72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳分離成像。DIG標(biāo)記探針試劑盒（Roche）標(biāo)記煙草鐵蛋白基因NtFer1 cDNA為探針，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》方法進(jìn)行Southern雜交。Trizol法提取葉片總RNA，取30 μg 65℃水浴5min，經(jīng)1%甲醛變性膠電泳分離后Northern雜交，方法同Southern雜交。

1.2.4轉(zhuǎn)基因植株生理指標(biāo)測定

經(jīng)抗性篩選和分子檢驗(yàn)后，將T1代轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ找浦脡衙鐮I養(yǎng)液中培養(yǎng)（Fe2+300 μmol·L-1），45 d測定植株上部葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）含量，并重復(fù)3次；30、45、60和110 d測定植株上部葉片葉綠素相對含量，并重復(fù)3次。SOD活性采用氮藍(lán)四唑光化學(xué)還原法測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法測定，葉綠素相對含量利用SPAD502葉綠素儀（美能達(dá)，Japan）測定。

1.2.5轉(zhuǎn)基因植株總Fe含量測定

根據(jù)Fe標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，濕式消解-原子吸收法測定總Fe含量（原子吸收分光光度計Z-2000，Japan），計算樣品加標(biāo)回收率。取T1代轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏‵e2+300 μmol·L-1、45 d）上部葉片烘干后測定總Fe含量，重復(fù)3次；成熟籽粒去除穎殼、烘干粉碎測定糙米中總Fe含量，重復(fù)3次。

1.2.6轉(zhuǎn)基因植株糙米氨基酸含量測定

取T1代轉(zhuǎn)基因植株等質(zhì)量混合樣本及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ粘墒旆N子，去除穎殼、粉碎、過篩、烘干，稱取100mg，加入8mL 6mol·L-1HCl吹入氮?dú)夥饪冢?10℃水解22 h，冷卻過濾定容至50mL，取1mL真空凍干加入1mL 0.02mol·L-1HCl，離心取上清0.8mL，過濾后全自動氨基酸分析儀（德國阿米諾西斯，A200）測定氨基酸含量，并重復(fù)3次。

1.2.7T1代轉(zhuǎn)基因植株稻瘟病抗性分析

采集黑龍江省粳稻主產(chǎn)區(qū)稻瘟病小種樣本，高粱培養(yǎng)基分離培養(yǎng)62個單孢菌株，菌體懸浮液調(diào)成濃度2×105孢子·mL-1，每個菌株取10mL懸浮液加入0.02%Tween 20混勻，噴霧器接種T1代轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖~一心幼苗（Fe2+300 μmol·L-1營養(yǎng)液培養(yǎng)），27℃、濕度90%，暗培養(yǎng)24 h，然后保持27℃、濕度90%、12 h·d-1光照培養(yǎng)，按國際水稻所稻瘟病抗性評價分級標(biāo)準(zhǔn)葉瘟分級標(biāo)準(zhǔn)，0、8、10和12 d調(diào)查葉瘟級別，根據(jù)病情指數(shù)公式計算稻瘟病病情指數(shù)[12-13]。

2　結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因植株分子檢測

為證明煙草鐵蛋白NtFer1基因cDNA是否整合到受體植株基因組中，對T0代抗性植株P(guān)CR檢測，抗性植株和質(zhì)粒750 bp處均擴(kuò)增出目的條帶，初步證明外源基因整合到受體植株基因組中（見圖1a）。從中選出3株長勢較好抗性植株，進(jìn)行Southern blot檢測，其均能與探針雜交出條帶（見圖1b），進(jìn)一步證明外源基因已整合到受體植株基因組中；分離總RNA進(jìn)行Northern blot檢測，轉(zhuǎn)基因植株中均檢測到相應(yīng)外源基因NtFer1表達(dá)的mRNA信號（見圖1c），表明外源基因NtFer1已在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。對上述3個轉(zhuǎn)基因植株自交的T1代抗性植株P(guān)CR檢測，抗性植株和質(zhì)粒均產(chǎn)生特異擴(kuò)增條帶，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ談t無特異擴(kuò)增條帶（見圖2），表明外源基因已在受體植株中穩(wěn)定遺傳。

圖1　T0代轉(zhuǎn)基因植株檢測結(jié)果Fig.1　Detection results of T0transgenic plants

圖2　T1代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測Fig.2　PCR electrophoretogram of T1transgenic plants

2.2T1代轉(zhuǎn)基因植株生理指標(biāo)比較分析

SOD和POD是活性氧清除劑，在植物抗氧化脅迫中具有清除氧自由基、防止脂膜過氧化及維持活性氧代謝平衡功能，均屬于抗氧化類酶[14-15]。MDA是脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子交聯(lián)聚合，具有細(xì)胞毒性，含量可作為評價細(xì)胞受到威脅嚴(yán)重程度指標(biāo)之一。Fe2+300 μmol·L-1條件下轉(zhuǎn)基因株系SOD活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?.52%～7.59%、POD活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?2.6%～17.6%（見圖3a、b），而MDA含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?6.98%～23.48%（見圖3c）。

圖3　T1代轉(zhuǎn)基因植株生理指標(biāo)變化Fig.3　Change of T1transgenic plants physiological index

上述差異表明，過量Fe2+脅迫下外源鐵蛋白基因NtFer1轉(zhuǎn)入表達(dá)能提高粳稻抗氧化酶活性，抑制或降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低MDA含量，提高葉片抗氧化能力。

葉綠素是綠色植物光合作用物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，葉片葉綠素含量與SPAD值呈顯著正相關(guān)，通過測定SPAD值可得到葉綠素相對含量[16-18]。Fe2+300 μmol·L-1條件下轉(zhuǎn)基因植株葉綠素相對含量在30和45 d時有高于非轉(zhuǎn)基對照趨勢，但差異不顯著，60和110 d時轉(zhuǎn)基因植株葉綠素相對含量高于對照5.1%～7.3%，且差異顯著（見圖4）。表明過量Fe2+脅迫下外源鐵蛋白基因NtFer1轉(zhuǎn)入表達(dá)能提高植株葉片葉綠素相對含量。

圖4　葉綠素相對含量Fig.4　Chlorophlly relative content

2.3T1代轉(zhuǎn)基因植株總鐵含量比較分析

Fe2+300 μmol·L-1條件下轉(zhuǎn)基因植株葉片總鐵含量高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?4.46%～20.45%，且差異顯著（見圖5a）；轉(zhuǎn)基因植株糙米總鐵含量高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?.44%～11.46%，且差異顯著（見圖5b）。表明過量Fe2+脅迫下外源鐵蛋白基因NtFer1轉(zhuǎn)入表達(dá)可提植株葉片和糙米總鐵含量。

2.4T1代轉(zhuǎn)基因植株糙米氨基酸含量比較分析

300μmol·L-1Fe2+條件下轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓瓴诿?6種氨基酸總含量無顯著差別，轉(zhuǎn)基因植株糙米天冬氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、組氨酸和賴氨酸含量顯著低于對照，谷氨酸、丙氨酸和亮氨酸含量略高于對照。外源鐵蛋白基因NtFer1轉(zhuǎn)入對轉(zhuǎn)基因植株糙米16種氨基酸總含量無顯著影響，但少數(shù)氨基酸含量與對照存在差異。結(jié)果見表1。轉(zhuǎn)入表達(dá)可提高植株稻瘟病抗性、降低稻瘟病葉瘟指數(shù)。

圖5　T1代轉(zhuǎn)基因植株總鐵含量Fig.5　Total iron contents of T1transgenic plants

表1　糙米氨基酸含量Table 1　Amino acid content of brown rice

表2　稻瘟病葉瘟指數(shù)Table 2　Leaf blast index of rice blast

2.5T1代轉(zhuǎn)基因植稻瘟病抗性分析

300μmol·L-1Fe2+條件下3個轉(zhuǎn)基因株系稻瘟病葉瘟指數(shù)8、10和12 d均低于對照，其中轉(zhuǎn)基因Nt2株系10、12 d分別低于對照16.3%、17.3%，且差異顯著。表明一定條件下外源鐵蛋白基因NtFer1

3　討論與結(jié)論

生物與非生物脅迫是影響作物生長、發(fā)育和產(chǎn)量的重要限制因素。抽取地下水灌溉會使旱田含鐵量增加數(shù)倍、稻田含鐵量增加100倍，潛育性土壤中Fe2+含量均高于植物正常需鐵量[19]，過量Fe2+脅迫會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞膜損傷和MDA含量上升等[20-21]。徐曉暉等研究表明鐵蛋白基因能提高植物過量Fe2+脅迫抗性[10]，葉霞等研究表明鐵蛋白基因能提高植株葉片和果實(shí)鐵含量[22]。本研究在過量Fe2+脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株葉片總鐵含量、糙米總鐵含量和抗氧化酶活性（SOD、POD）較對照顯著增加，而MDA含量顯著低于對照，與前人研究結(jié)果相似[10,22]。研究表明過量Fe2+脅迫下植株葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)、葉綠素含量下降[8,23]，而本研究中轉(zhuǎn)基因植株葉綠素相對含量60和110 d顯著高于對照，推測外源鐵蛋白基因NtFer1轉(zhuǎn)入表達(dá)能降低植株游離鐵離子含量并增加無毒、可利用鐵離子貯藏量，大量可利用鐵離子可促進(jìn)葉綠素相對含量增加、延緩葉片失綠。本研究中過量Fe2+脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株抗氧化酶活性（SOD、POD）及葉片和糙米總鐵含量均高于對照而MDA含量低于對照，表明煙草鐵蛋白基因NtFer1對提高植株過量Fe2+脅迫抗性具有重要作用。

本研究過量Fe2+脅迫條件下轉(zhuǎn)基因株系稻瘟病指數(shù)低于對照，與程志強(qiáng)等研究結(jié)果相似[24]，通過對葉片總鐵含量測定發(fā)現(xiàn)相近時間轉(zhuǎn)基因植株葉片總鐵含量顯著高于對照，原因是葉片中相對較高的總鐵含量抑制稻瘟病對葉片侵害，當(dāng)?shù)疚敛〔【秩救~片后受侵染部位鐵蛋白釋放儲藏的鐵離子，催化Fenton反應(yīng)生成具有強(qiáng)氧化力的羥自由基（·OH）抑制稻瘟病病菌增長，而未受病菌侵染部位鐵離子以可溶、無毒狀態(tài)儲藏在葉片鐵蛋白中。煙草鐵蛋白基因NtFer1對提高植株稻瘟病抗性具有作用，抗病機(jī)理則有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，煙草鐵蛋白基因NtFer1整合到粳稻東農(nóng)427基因組并穩(wěn)定遺傳表達(dá)，外源鐵蛋白基因NtFer1轉(zhuǎn)入表達(dá)提高植株抗氧化脅迫能力、葉片和糙米儲藏鐵離子能力，同時降低過量Fe2+對植株毒害程度、增強(qiáng)葉片對稻瘟病抗性。

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Research on gene function and japonica genetic transformation of tobacco ferritin geneNtFer1

TANG Xinhua1,JIANG Tingbo2,GAO Hongxiu1,WANG Jingguo1,ZOU Detang1(1.School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030, China;2.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

We transformated tobacco ferritin geneNtFer1 into japonica genome byAgrobacteriummediatedmethod,and the transformation was confirmed by resistance screening,PCR,Southern blotting and Northern blotting.T1generation was cultured in overmuch Fe2+nutrient solution,and then we tested the physiological and biochemical indicators.The results showed that comparing to the wild type plants,SOD, POD activity and relative chlorophyll content of transgenic lines were increased,while themDA content was decreased;the iron content in leaves and brown rice of transgenic lines were higher than the control,total amino acids(16 kinds)showed no significant difference,while some content had difference;after inoculation by rice blastmixed bacteria,the rice blast index of transgenic lines were lower than the control.Our research indicated that tobacco ferritin geneNtFer1 transgenic japonica could enhance the Fe2+storage ability of leaves and brown rice,and improve iron stress and rice blast resistance.

NtFer1;iron content;japonica;rice blast

S511；Q785

A

1005-9369（2016）04-0073-06

2015-12-24

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題（2013BAD20B04）；國家科技支撐計劃項目（2011BAD16B11,2011BAD35B02-01-01）

唐鑫華（1982-），男，實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向?yàn)樽魑锓肿舆z傳育種。E-mail:tangxinhua821@sina.com

鄒德堂，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗具z傳育種。E-mail:zoudetang0103@sina.com