張愛紅，崔 禹，楊 菲，邸墊平，閆 沖，苗洪芹

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室,河北保定 071000; 2.河北金融學(xué)院，河北保定 071051)

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二穗短柄草被確定為水稻黑條矮縮病毒的新寄主

張愛紅1，崔 禹2，楊 菲1，邸墊平1，閆 沖1，苗洪芹1

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室,河北保定 071000; 2.河北金融學(xué)院，河北保定 071051)

二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)是一種新興的模式植物，在病毒-植物的互作研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)是一種重要的植物病毒，明確該病毒是否能夠侵染二穗短柄草，是進(jìn)行病毒-寄主互作研究的前提。本研究利用傳毒介體灰飛虱將RBSDV人工接種于二穗短柄草Bd21，觀察RBSDV是否侵染短柄草，以及侵染后的癥狀發(fā)展過程，同時對病毒進(jìn)行了PCR檢測。結(jié)果顯示，RBSDV可以侵染二穗短柄草；初期癥狀為節(jié)間縮短，隨后表現(xiàn)植株矮縮、心葉扭曲、缺刻等癥狀；PCR檢測有明顯的目的條帶。由此確定二穗短柄草是RBSDV的新寄主，可作為該病毒與寄主互作的研究材料。這為進(jìn)行RBSDV抗病基因鑒定、基因組學(xué)研究以及農(nóng)作物的抗病育種奠定了基礎(chǔ)。

二穗短柄草； RBSDV；寄主

水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)是一種雙鏈RNA病毒，屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)，由灰飛虱以持久性方式傳播[1]。該病毒的寄主主要包括小麥(Triticumspp.)、大麥(Hordeumspp.)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、高粱(Sorghumvulgare)、谷子(Setariaitalica)、馬唐(Digitariasanguinali)、風(fēng)稗(Eechinochloacrusgalli)、燕麥(Avenasativa)、狗尾草(Setariaspp.)、狗牙根(Cynodondactylon)等57種禾本科植物[2]。在我國，RBSDV主要對小麥、玉米、水稻等作物造成嚴(yán)重危害。RBSDV侵染玉米引起玉米粗縮病，侵染小麥引起小麥綠矮病，侵染水稻引起水稻黑條矮縮病，這3種病害是我國小麥、玉米、水稻種植區(qū)內(nèi)重要的共生病毒病害[3]。該類病害曾在中國、日本等東南亞國家流行，對水稻、小麥、大麥、玉米、高粱造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[4]。研究RBSDV與寄主的互作機(jī)制，尋找抗病資源是防治該病毒危害的根本途徑，也是當(dāng)前植物病毒研究的熱點。水稻因經(jīng)濟(jì)價值較高，并具有模式植物的優(yōu)點，RBSDV與水稻的互作研究常見報道[5]。但在我國北方，小麥、玉米是RBSDV的主要侵染作物，田間禾本科雜草是完成病毒侵染的橋梁寄主[6-7]。由于水稻生育期較長，需要嚴(yán)格的生長條件，基因組DNA序列與普通小麥、大麥等溫帶禾本科植物差異較大，限制了水稻作為模式植物在單子葉植物中的通用性[8]。

短柄草(Brachypodiumdistachyon)是一種廣泛分布于溫帶地區(qū)的禾本科植物，生育周期短，一年可生長5代，原產(chǎn)于非洲北部、歐洲南部和亞洲中部，與小麥、大麥和燕麥同屬早熟禾亞科[9-10]。近幾年來，短柄草作為模式植物引起了國內(nèi)外分子生物學(xué)研究者的重視。目前，二穗短柄草的基因組全長已測序完成，通過對二穗短柄草植物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)特性、基因組學(xué)等相關(guān)研究，短柄草已成為水稻之外的另一種模式植物[11]，可用以獲取禾本科基因尤其是麥類基因中所缺少的重要基因共線區(qū)信息。

研究表明，麥類作物的白粉病菌、條銹病菌和稻類作物的稻瘟病菌等均能侵染短柄草植株，并引起相應(yīng)癥狀[12-13]，但是田間危害嚴(yán)重的植物病毒是否侵染短柄草，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。RBSDV是一種能對多種作物產(chǎn)生危害的植物病毒，探索RBSDV對其他植物尤其是禾本科模式植物的致病性及其特點，對于建立病毒-植物互作模式系統(tǒng)以及獲得新的抗性資源具有重要意義。本研究利用人工接種的方法，將RBSDV接種于二穗短柄草，觀察短柄草是否侵染以及其發(fā)病特點，以期為下一步建立RBSDV與寄主的互作模式體系，為禾本科作物抗病基因的篩選和鑒定奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試材料

采用二穗短柄草二倍體材料Bd21作為實驗材料，灰飛虱飼養(yǎng)寄主及毒源繁殖寄主為河北省小麥主要推廣品種石新828。

TRIZol植物總RNA提取試劑盒、一步法RT-PCR檢測試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2無毒灰飛虱群體的獲得

春季用扣網(wǎng)采集麥田灰飛虱，飼養(yǎng)于防蟲罩罩好的小麥苗上。待成蟲產(chǎn)卵、1齡若蟲孵化后，收集孵化幼蟲，轉(zhuǎn)至新鮮小麥苗上繼續(xù)飼養(yǎng)。在溫室環(huán)境溫度為23±2 ℃、相對濕度為(70±5)%、14 h 光照的條件下，繼續(xù)擴(kuò)大繁殖，以此獲得無毒灰飛虱群體。

1.3RBSDV毒源的繁殖

大田玉米拔節(jié)前，采集田間植株矮化、葉色深綠、葉片背面有蠟白色突起等具有RBSDV侵染典型癥狀的玉米植株移栽至溫室，作為初始毒源。利用無毒灰飛虱將RBSDV傳毒至小麥植株。取表現(xiàn)植株矮縮、葉色濃綠、心葉有缺刻及分蘗增多癥狀的典型小麥病株作為人工接種用毒源。

1.4二穗短柄草的RBSDV侵染

將溫室飼養(yǎng)的2～3齡無毒灰飛虱群體飼毒于自繁小麥毒源，飼毒4 d后，將灰飛虱取出置于健康小麥苗上，在環(huán)境溫度為23±2 ℃的養(yǎng)蟲室中渡過循回期，以獲得帶毒灰飛虱[14]。采用網(wǎng)箱集團(tuán)接種的方式[14]，按照每苗平均5蟲的蟲量，接種于3葉期二穗短柄草，接種4 d。接種環(huán)境溫度23±2 ℃、相對濕度(70±5)%、光照14 h/黑暗10 h。同時設(shè)未接種對照以及小麥接種對照。逐日調(diào)查接種后植株的癥狀發(fā)展過程。

1.5接種后二穗短柄草的分子生物學(xué)測定

1.5.1植物總RNA提取

TRIzol植物總RNA提取參照試劑盒說明書進(jìn)行。采集已接種的二穗短柄草上部葉片，稱取0.1 g樣品，加入800 μL TRIzol、適量研磨珠，在德國萊馳MM400混合型研磨儀中研磨1.5 min，振動頻率為30 HZ·s-1，研磨結(jié)束后樣品4 ℃靜置5 min，加入1/5體積的氯仿，劇烈震蕩30 s，4 ℃靜置5 min，12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min。取上清，加入等體積異丙醇，4 ℃靜置10 min，12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，保留沉淀，加入200 μL預(yù)冷的75%乙醇，洗滌沉淀，8 000 r·min-1、4 ℃離心5 min，保留沉淀。加入300 μL冷凍無水乙醇，8 000 r·min-1、4 ℃離心5 min，棄上清，在超凈工作臺風(fēng)干。每管加入20 μL DEPC處理水，溶解沉淀，-80 ℃保存。

1.5.2一步法RT-PCR檢測

根據(jù)已報道的RBSDV segment S10序列設(shè)計引物。上游引物：5′-TTACCCAACATCACGC AACT-3′，下游引物：5′-GAGCAGGAACTT CACGACAAC-3′，擴(kuò)增片段大小為337 bp，由上海生工生物工程公司合成。

一步法RT-PCR檢測參照其試劑盒說明書進(jìn)行。在12.5 μL的反應(yīng)體系中加入2× OneStep RT-PCR Buffer 6.25 μL，上下游引物各0.5 μL，RNA模板1 μL，HiFi-MMLV OneStep RT-PCR EnzymeMix 0.25 μL，用RNase-Free水補足體系。將循環(huán)儀預(yù)熱到45 ℃，將PCR管置于熱循環(huán)儀中，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為反轉(zhuǎn)錄45 ℃ 30 min；預(yù)變性95 ℃ 2 min，變性94 ℃ 30 s，退火50 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；終延伸72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

以小麥病株為陽性對照，健康小麥及健康二穗短柄草植株為陰性對照，對顯示特定癥狀的二穗短柄草病株樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，明確其感染RBSDV的情況。取部分?jǐn)U增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測序。

2　結(jié)果與分析

2.1RBSDV侵染后二穗短柄草的癥狀表現(xiàn)

在環(huán)境溫度23±2 ℃、相對濕度(70±5)%、光照14 h/黑暗10 h的條件下，二穗短柄草接種45 d后節(jié)間逐漸縮短，50 d后葉片開始扭曲、逐漸變形，55 d后葉片出現(xiàn)缺刻癥狀，植株逐漸矮化(圖1)，接種60 d后較正常株(圖2)矮化明顯。二穗短柄草發(fā)病后期可抽穗，但較正常株穗小且不飽滿。同等接種條件下，小麥和二穗短柄草表現(xiàn)出的矮化、心葉扭曲、缺刻等癥狀一致，但小麥接種20 d后即可出現(xiàn)節(jié)間縮短的癥狀，30 d后出現(xiàn)心葉扭曲、缺刻的癥狀(圖3)。由此可見，二穗短柄草接種后典型癥狀及癥狀發(fā)展過程與小麥一致，但RBSDV在二穗短柄草植株中的潛育期要長于同環(huán)境下該病毒在小麥中的潛育期。

A：心葉扭曲；B：缺刻；C：果穗?。籇：矮化　　A：Leaf distortion；B：Leaf notches；C：Small ears；D：Stunting

2.2RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，陽性對照(小麥病株)擴(kuò)增出單一且符合預(yù)期大小的337 bp的條帶，陰性對照(健康的小麥、二穗短柄草植株)未擴(kuò)增出任何條帶，部分接種RBSDV的二穗短柄草植株樣品中也擴(kuò)增到與預(yù)期大小一致的片段(圖4)，包括1株表現(xiàn)侵染癥狀的植株(圖4第6泳道)和1株未表現(xiàn)典型癥狀的植株(圖4第8泳道)。對RT-PCR檢測結(jié)果為陽性的二穗短柄草病株樣品擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行測序，測得的序列于GenBank中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列與張恒木等[15]測得的RBSDV的segment S10全序列相似性為99%。因此，可以確認(rèn)上述樣品確為RBSDV所感染。

A：心葉；B：穗子；C：植株　　A：Leaf;B:Ears;C:Plant

A：心葉扭曲；B：缺刻；C：矮化；D：健康植株　　A:Leaf distortion;B:Leaf notches;C:Stunting；D：Healthy plant

M：DL2000；1：陽性對照(小麥病株)；2～3：陰性對照(健康小麥及二穗短柄草植株)；4～12：接種RBSDV的二穗短柄草

M: DL2000; 1:Positive control(Triticumspp plant infected by RBSDV); 2-3:Negative control(Healthy plants ofTriticumspp andBranchypodiumdistachyon); 4-12: Samples ofBrachypodiumdistachyon

圖4RT-PCR檢測結(jié)果

Fig.4Results of RT-PCR detection

3　討 論

本試驗利用灰飛虱將RBSDV接種于二穗短柄草，研究了RBSDV在二穗短柄草中的致病過程及特點。結(jié)果表明，RBSDV能夠侵染二穗短柄草，并表現(xiàn)出系統(tǒng)侵染的癥狀。這一致病過程及癥狀與RBSDV侵染小麥后的典型癥狀極其相似。研究中發(fā)現(xiàn)，除表現(xiàn)典型病毒侵染癥狀的二穗短柄草經(jīng)RT-PCR能夠檢出明顯條帶外，一株未表現(xiàn)出明顯癥狀的二穗短柄草也檢測出了條帶，只是條帶亮度略暗，這可能與RBSDV在其中濃度較低，暫時未引起相關(guān)癥狀有關(guān)。灰飛虱是多種植物病毒的傳播介體，不僅能夠傳播RBSDV，還能傳播水稻條紋葉枯病毒(Rice stipe virus)[16]、北方禾谷花葉病毒(Northern cereal mosaic virus)[17]、大麥黃條點花葉病毒(Barley yellow striate mosaic rhabdovirus)[18]等多種危害水稻、小麥的病毒病。那么灰飛虱傳播其他病毒侵染短柄草也是可能的，這值得進(jìn)一步研究。

二穗短柄草是禾本科早熟禾亞科第一個被測序的物種，其基因組序列與黑麥草、小麥、大麥等早熟禾亞科植物高度相似。作為一種新的模式植物，二穗短柄草將成為水稻的有力補充。明確RBSDV與寄主之間的致病性、侵染行為以及伴隨的基因行為，對明確病毒與植物的互作機(jī)理以及挖掘新的抗性資源具有重要的指導(dǎo)作用。

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Brachypodiumdistachyon,a New Host of Rice Black-Streaked Dwarf Virus

ZHANG Aihong1，CUI Yu2,YANG Fei1，DI Dianping1，YAN Chong1，MIAO Hongqin1

(1.Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Science/Integrated Pest Management Center of Hebei Province/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China,Ministry of Agriculture,Baoding,Hebei 071000,China; 2.Hebei Finance University,Baoding,Hebei 071051,China)

Brachypodiumdistachyonis a relatively ideal model plant for gramineous plants research at present.Rice black-streaked dwarf virus(RBSDV) is one of the most important virus in China, where it causes severe yield loss.Whether RBSDV infectedBrachypodiumdistachyonor not, is the premise to establish virus-host interaction model. An inoculation method was developed to investigate the infection process and symptom development. Meanwhile, RBSDV was detected with PCR inB.distachyon.The results show that:B.distachyoncould be infected by RBSDV. Typical symptoms such as stunting of plants, leaf distortion, small ears, outward-pointing notches could be observed in the plants. Furthermore, a clear single target band indicates thatB.distachyoncould be infected by RBSDV. According to these results,B.distachyon, a new host of RBSDV, can be used as a candidate to study virus-plant interactions.

Brachypodiumdistachyon； Rice black-streaked dwarf virus；Host

2016-01-12

2016-02-26

973計劃項目(2014CB138400)

E-mail：zhangaihong08@163.com

苗洪芹(E-mail：miao5058345@163.com)

S512.9；S435.1

A

1009-1041(2016)08-1101-05

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-08-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160801.1123.026.html