程雪妮，劉 洋，龐玉輝,3，雷忠萍，武 軍，陳新宏，楊群慧，趙繼新

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100； 3.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南洛陽 471023)

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小麥-濱麥附加易位系DM 5911的創(chuàng)制及其細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定

程雪妮1，劉 洋2，龐玉輝2,3，雷忠萍1，武 軍2，陳新宏2，楊群慧2，趙繼新2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100； 3.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南洛陽 471023)

濱麥(Leymusmollis(Trin.) Pilger,NsNsXmXm,2n=28)具有抗旱、耐寒、抗多種真菌和細(xì)菌病害、莖稈粗壯、大穗多花等特性，是麥類作物品種改良的優(yōu)異種質(zhì)資源。本研究采用細(xì)胞遺傳學(xué)方法對由八倍體小濱麥M842-16與硬粒小麥品種D 4286雜交F6代選育出的1個(gè)附加易位系DM 5911進(jìn)行了鑒定和農(nóng)藝性狀分析。細(xì)胞學(xué)鏡檢顯示，DM 5911的染色體構(gòu)型為2n=44=22Ⅱ；根尖體細(xì)胞原位雜交鑒定顯示，DM 5911含有2條完整的Ns染色體和2條易位的Ns染色體；花粉母細(xì)胞原位雜交鑒定顯示，DM 5911的2條完整Ns染色體和2條易位Ns染色體可以進(jìn)行正常的聯(lián)會配對和遺傳。表明DM 5911是1個(gè)遺傳穩(wěn)定、包含1對完整的Ns染色體和1對易位Ns染色體的小濱麥附加易位系。形態(tài)學(xué)調(diào)查顯示，DM 5911在株高和分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀方面得到了明顯的改善。該附加易位系作為進(jìn)一步創(chuàng)制小濱麥小片段染色體易位系的重要種質(zhì)材料，可用于小麥染色體工程育種與遺傳改良。

小麥； 濱麥； 附加； 易位； 基因組原位雜交

小麥遠(yuǎn)緣雜交是研究小麥進(jìn)化及親緣關(guān)系、人工合成新物種、利用外源遺傳物質(zhì)豐富小麥遺傳基礎(chǔ)的重要途徑和手段[1-2]。濱麥(Leymusmollis(Trin.) Pilger,NsNsXmXm,2n=28)，又名柔軟賴草，屬禾本科大麥亞族賴草屬野生雜草，具有抗旱、耐寒、耐鹽堿、耐瘠薄、抗多種真菌與細(xì)菌病害、莖稈粗壯、大穗多花等特性，是麥類作物品種改良的優(yōu)異種質(zhì)資源[3-4]。濱麥基因組為NsNsXmXm，其中Ns基因組來自于新麥草(PsathyrostachysKeng)，而Xm基因組的來源目前尚未確定[5-6]。

20世紀(jì)50-60年代，前蘇聯(lián)的Tsitsin等[7]通過幼胚培養(yǎng)，獲得了四倍體、六倍體小麥與大賴草、濱麥和沙生賴草的雜種。Anamthawat-Jónsson 等[8-9]采用胚拯救和秋水仙堿加倍，獲得了普通小麥、波斯小麥與濱麥的雜種雙二倍體，并報(bào)道了1個(gè)包含全部A和B基因組染色體、1對D基因組染色體和6對濱麥染色體的小麥-濱麥雙二倍體材料AD 99，利用AD 99與普通小麥雜交，篩選出了6個(gè)抗白粉病的純合株系。陳漱陽等[10]、傅 杰等[11]自20世紀(jì)80-90年代開始進(jìn)行普通小麥與濱麥的雜交研究，通過胚拯救和秋水仙堿染色體加倍，獲得了具有濱麥的大穗、多花、大粒、抗病等特性的八倍體小濱麥(octoploidTritileymus) M 842。王獻(xiàn)平等[12]對6 種類型的八倍體小濱麥的染色體組構(gòu)成進(jìn)行了分子細(xì)胞遺傳學(xué)分析，將八倍體小濱麥M 842-4、M 842-8、M 842-12、M 842-16 的染色體組構(gòu)成確定為AABBDDNN，M 842-10 的染色體組構(gòu)成確定為AABBDDNN+2Ta-2Lm(N)，M 842-13 的染色體組構(gòu)成確定為AABBDDJJ。利用八倍體小濱麥M 842與普通小麥品種7182、煙農(nóng)15和缺體小麥等雜交，前人已培育出3個(gè)異附加系[13]、2個(gè)二體異代換系[14]和10多個(gè)易位系[15-18](M 853、M 8657、WM-10、93748、山農(nóng)0096、山農(nóng)6343、WL 24-4等)新種質(zhì)。此外，M 842與八倍體小偃麥、八倍體小簇麥和八倍體小黑麥雜交，獲得了一些小麥-濱麥-偃麥草[19]、小麥-濱麥-簇毛麥[20]和小麥-黑麥-濱麥[21]等三屬雜種，并將濱麥的抗條銹病、抗白粉病等基因?qū)氲搅似胀ㄐ←溨小?/p>

近年來，本課題組利用八倍體小濱麥M 842與硬粒小麥品種D 4286和Trs-372進(jìn)行了雜交研究[22]，并在后代中鑒定出了一些新種質(zhì)。在八倍體小濱麥M 842-12與硬粒小麥Trs-372的雜交后代中，鑒定出1個(gè)小麥1D、5D、6D染色體被濱麥1Ns、5Ns、6Ns染色體替換了的多重異代換系05DM6[23]；在八倍體小濱麥M 842-16與硬粒小麥D 4286的雜交后代中，鑒定出1個(gè)小麥3D、6D、7D染色體被濱麥3Ns、6Ns、7Ns染色體替換了的多重異代換系10DM50[24]和1個(gè)小麥3D染色體被濱麥3Ns染色體替換了的二體異代換系10DM57[25]。

本研究在M 842-16×D 4286的雜交后代中，篩選出了1個(gè)染色體數(shù)目為2n=44，含有2條完整濱麥Ns染色體和2條易位Ns染色體的株系DM 5911，對其進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)和基因組原位雜交鑒定，并對其農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查，以期為小麥品種改良和染色體工程育種提供新的種質(zhì)資源。

1　材料與方法

1.1供試材料

小濱麥附加易位系DM 5911，來自M 842-16×D 4286的F6世代；八倍體小濱麥M 842-16是普通小麥7182(Triticumaestivumcv. 7182，AABBDD，2n=42)與濱麥(Leymusmollis)雜交F1代經(jīng)胚拯救而獲得的雙二倍體，其染色體組成為AABBDDNsNs，2n=56；華山新麥草(Psathyrostachyshuashanica，NsNs，2n=14)作為基因組原位雜交鑒定時(shí)Ns基因組特異探針，用來檢測雜交后代中的濱麥Ns染色體；硬粒小麥品種D 4286(Triticumdurumcv. D 4286，AABB，2n=28)和普通小麥品種7182為農(nóng)藝性狀調(diào)查時(shí)的參考對照；這些材料均保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞遺傳學(xué)分析

小麥根尖體細(xì)胞觀察：小麥種子于室內(nèi)發(fā)芽，待根長至1～2 cm 時(shí)，剪取根尖于0～4 ℃冰水預(yù)處理24 h，卡諾固定液(無水乙醇∶冰乙酸= 3∶1) 固定，70%乙醇保存，醋酸洋紅染色壓片；Olympus BX60 顯微鏡觀察并照相。

花粉母細(xì)胞觀察：田間取適齡幼穗，取花粉用卡諾固定液(無水乙醇∶氯仿∶冰乙酸= 6∶3∶1)固定，醋酸洋紅染色壓片；Olympus BX60 顯微鏡觀察并照相。

1.2.2基因組原位雜交(Genomicinsituhybridization，GISH)

DNA提取及探針標(biāo)記：采用CTAB法[26]提取濱麥和華山新麥草全基因組DNA。依照Dig-Nick-Translation Mix試劑盒(Roche，Germany)使用說明對華山新麥草的全基因組DNA進(jìn)行標(biāo)記。

染色體制片及原位雜交：參照文獻(xiàn)[12]與[22]的方法進(jìn)行。每張制片加40 μL雜交液，包含20×SSC 4 μL，ssDNA(鮭魚精DNA，5 μg·μL-1) 1 μL，10%(W/V)SDS(十二烷基磺酸鈉) 1 μL，50%(W/V)DS(硫酸葡聚糖) 8 μL，去離子甲酰胺20 μL，探針DNA 100 ng，無菌去離子水加至40 μL。95 ℃變性8 min，雜交在hybrite原位雜交儀(Thermo,USA)上依照程序(75 ℃ 8 min，37 ℃ 16 h)進(jìn)行。Olympus BX60熒光顯微鏡觀察，Pixera Penguin 150CL顯微數(shù)碼CCD照相。

1.2.3農(nóng)藝性狀調(diào)查

供試材料于2013-2015年度先在實(shí)驗(yàn)室發(fā)芽后，將幼苗移栽于發(fā)芽盤，待幼苗長至一葉一心時(shí)，移栽至西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥試驗(yàn)地。在成熟期調(diào)查供試材料的株高、分蘗數(shù)、穗長、小穗數(shù)、穗下莖節(jié)長度、結(jié)實(shí)率等性狀。均隨機(jī)調(diào)查10個(gè)樣本，取平均值。采用t測驗(yàn)方法對DM 5911和普通小麥親本7182在各性狀上的差異進(jìn)行顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1DM 5911根尖體細(xì)胞染色體的鑒定結(jié)果

利用M842-16(AABBDDNN，2n=56)與硬粒小麥品種D 4286(AABB，2n=28)雜交，后代經(jīng)套袋自交，在F6世代中，通過根尖體細(xì)胞染色體鏡檢，篩選到1株2n=44的植株，收獲該單株。隨機(jī)選取15粒該單株種子進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鏡檢，結(jié)果表明，15粒種子的根尖體細(xì)胞染色體數(shù)目都為44條(圖1A)。隨機(jī)選取該株系6個(gè)單株，用華山新麥草基因組DNA為探針進(jìn)行GISH鑒定，結(jié)果(圖1B)顯示，這6個(gè)單株除了2條完整的染色體顯示黃綠色熒光信號外，還有2條染色體部分顯示黃綠色熒光信號，由此確定該株系含有2條完整的Ns染色體和2條易位的Ns染色體，將該株系命名為DM 5911。

2.2DM 5911花粉母細(xì)胞染色體鑒定結(jié)果

田間選取DM 5911的適齡幼穗，對45個(gè)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體配對情況進(jìn)行鏡檢，結(jié)果顯示，DM 5911有38個(gè)花粉母細(xì)胞的染色體構(gòu)型為2n=22Ⅱ，占觀察細(xì)胞數(shù)的84.5%；在二價(jià)體中，環(huán)狀二價(jià)體占有很高的比例，達(dá)到82.6%，平均每個(gè)細(xì)胞有18.0個(gè)，而棒狀二價(jià)體僅占17.4%，平均每個(gè)細(xì)胞有3.8個(gè)(圖2A，表1)。以華山新麥草總基因組DNA作為探針，對其花粉母細(xì)胞進(jìn)行基因組原位雜交鑒定，結(jié)果顯示，DM 5911花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ細(xì)胞除了含有1個(gè)完整的二價(jià)體顯示黃綠色信號外，還有1個(gè)棒狀二價(jià)體在兩端顯示黃綠色信號(圖2B)，在減數(shù)分裂后期Ⅰ，伴隨著細(xì)胞分裂，完整的Ns二價(jià)體和易位的Ns二價(jià)體均正常的分離為2條染色單體向細(xì)胞兩極移動(圖2C)。表明DM 5911中的2條完整的Ns染色體和2條易位的Ns染色體都進(jìn)行了正常的聯(lián)會配對和遺傳。由此說明，DM 5911是1個(gè)遺傳穩(wěn)定、包含1對完整的Ns染色體和1對易位Ns染色體的小濱麥附加易位系。

2.3DM 5911的形態(tài)學(xué)特征

對DM 5911及其親本硬粒小麥品種D 4286和八倍體小濱麥M 842-16的形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果(圖3)顯示，DM 5911株高明顯變矮，平均株高為65.9 cm，比雙親都低(圖3A)；穗形與親本M 842-16較為接近，都為紡錘形，芒的長度明顯變短，與親本M 842-16較為接近(圖3B)。DM 5911的分蘗數(shù)、穗長、小穗數(shù)以及結(jié)實(shí)率均介于雙親之間，而株高和穗下莖節(jié)長度均明顯低于雙親。方差分析表明，DM 5911與親本M 842-16、D 4286、7182相比，分蘗數(shù)和穗下莖節(jié)長度差異顯著，株高、小穗數(shù)、穗粒數(shù)和結(jié)實(shí)率等性狀差異極顯著，穗長差異不顯著(表2)。

箭頭指示小麥-濱麥Ns易位染色體。

Arrows show two chromosomes translocated between wheat and Ns chromosomes.

圖1DM 5911的根尖體細(xì)胞染色體(A)及其基因組原位雜交鑒定(B)

Fig.1 Somatic chromosomes in the root tips(A) and its identification by GISH(B) in DM 5911

圖B中，箭頭指示Ns易位二價(jià)體；圖C中，白色箭頭指示Ns易位染色體，藍(lán)色箭頭指示Ns完整染色體。

Arrows show translocated Ns bivalent in Fig.B;Blue and white arrows in Fig.C show whole Ns chromosomes and translocation Ns chromosomes,respectively.

圖2DM 5911花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體(A)及其減數(shù)分裂中期Ⅰ和后期 Ⅰ基因組原位雜交鑒定(B和C)

Fig.2Chromosome behavior in PMCs at metaphase Ⅰ(A) and its GISH identification at metaphase Ⅰ and anaphase Ⅰ(B and C) in PMCs in DM 5911

材料Material觀察細(xì)胞數(shù)No.ofcellsobserved2n染色體構(gòu)型Chromosomeconfiguration22Ⅱ21Ⅱ+2Ⅰ20Ⅱ+4Ⅰ染色體配對ChromosomepairⅠⅡ總數(shù)Total環(huán)狀Rings棒狀RodsDM5911454438(84.5%)5(11.1%)2(4.4%)0.4(0～4)21.8(20～22)3.8(0～7)18.0(15～21)

表2　DM 5911及其親本的形態(tài)學(xué)特征

括號內(nèi)數(shù)據(jù)為性狀變異范圍；*和**分別表示在P<0.05 和P<0.01水平上與其他3個(gè)材料差異顯著。

Agronomic trait variation range are shown in brackets; * and ** indicate significant differences with other three materials atP<0.05 andP<0.01,respectively.

3　討 論

自20世紀(jì)50-60年代以來，前人通過胚拯救和秋水仙堿染色體加倍等技術(shù)，先后獲得了許多六倍體和八倍體小麥-濱麥雜種[3,7-8,11]。以八倍體小濱麥M 842為親本，國內(nèi)研究者創(chuàng)制出了一系列異附加系、異代換系和易位系等小濱麥衍生后代材料。傅 杰等[13-14]通過M842與普通小麥和缺體小麥雜交，培育出了3個(gè)異附加系和2個(gè)異代換系。周兗晨等[18]在M 842與普通小麥品種7182的雜交后代中鑒定出了抗條銹病的小濱麥易位系93748。王獻(xiàn)平等[17]利用含殺配子基因的小麥-離果山羊草(AegilopstriuncialisL.) 3C異附加系與小濱麥異代換系M 8724、M 852雜交篩選出了3個(gè)小濱麥易位系。陸文輝等[15]、王金平等[16]通過M 842與小麥品種煙農(nóng)15雜交，篩選到了1個(gè)綜合性狀優(yōu)良、抗小麥條銹病的小濱麥易位系山農(nóng)0096和1個(gè)兼抗小麥白粉病和條銹病的小濱麥易位系山農(nóng)6343。本研究利用八倍體小濱麥M 842與硬粒小麥品種D 4286雜交，在F6代選育出了1個(gè)染色體數(shù)為2n=44=22Ⅱ的小濱麥衍生株系DM 5911，根尖體細(xì)胞和花粉母細(xì)胞的原位雜交研究表明，該株系含有1對完整的Ns染色體和1對易位Ns染色體，且外源Ns染色體可以穩(wěn)定遺傳，由此確定該株系為小濱麥附加易位系，推斷其染色體組成應(yīng)為2n=44=40W + 2Ns + 2T(W表示小麥染色體，Ns表示濱麥染色體，T表示易位染色體)。

本研究中，八倍體小濱麥(2n=56，AABBDDNsNs)與硬粒小麥(2n=28，AABB)進(jìn)行雜交，來自八倍體小濱麥的包含單倍A、B、D、Ns基因組的配子和來自硬粒小麥的含A、B基因組的孢子結(jié)合后，F(xiàn)1的染色體組成為2n=42=AABB+7D+7Ns，其中，來源于八倍體小濱麥的A和B基因組與來源于硬粒小麥的A和B基因組可以很好的配對，而來自八倍體小濱麥的D和Ns基因組，由于沒有可以配對的染色體而處于單價(jià)體狀態(tài)，因此在雜交后代自交過程中，能完全聯(lián)會配對的A、B基因組染色體可以進(jìn)行正常解旋分離，從而遺傳到子代；而處于單價(jià)體狀態(tài)的D和Ns基因組染色體，由于處于游離狀態(tài)，因此，在減數(shù)分裂形成配子時(shí)進(jìn)行隨機(jī)分離，并有可能丟失，自交后代中會出現(xiàn)染色體數(shù)不足42條的情況，我們在對F2和F3代株系進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定的時(shí)候均觀察到了這種現(xiàn)象。在自交過程中，含有相同染色體組成的配子結(jié)合后就會形成穩(wěn)定的包含多種染色體組成的小濱麥衍生后代。我們已經(jīng)在M 842-12與Trs-372的雜交后代中，選育出1個(gè)包含濱麥1Ns、5Ns和6Ns染色體的多重異代換系05DM6[23]；在M 842-16與D 4286的雜交后代中，鑒定出了1個(gè)包含濱麥3Ns、6Ns和7Ns染色體的小濱麥多重異代換系10DM50[24]和1個(gè)小濱麥3Ns/3D二體異代換系10DM57[25]。本研究中，在M 842-16與D 4286的雜交F6代中，鑒定出了1個(gè)2n=44、包含1對完整的Ns染色體和1對易位Ns染色體附加易位系DM 5911。農(nóng)藝性狀調(diào)查顯示，DM 5911具有株高變矮、分蘗數(shù)增多等特性，尤其是株高僅65.9 cm，比親本均低，而濱麥的株高為60 cm[12]，推測該株系中附加和易位的濱麥Ns染色體可能攜帶有濱麥的矮桿基因。該株系可作為進(jìn)一步創(chuàng)制小濱麥小片段染色體易位系、研究濱麥染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及其所載濱麥農(nóng)藝性狀的重要種質(zhì)材料，用于小麥染色體工程育種與遺傳改良研究。

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Development and Cytogenetics Identification of a Wheat-LeymusmollisAddition and Translocation Line DM 5911

CHENG Xueni1,LIU Yang2,PANG Yuhui2,3,LEI Zhongping1,WU Jun2,CHEN Xinhong2,YANG Qunhui2,ZHAO Jixin2

(1.College of Life Science,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.The Key Laboratory of Plant Genetic Engineering and Breeding of Shaanxi Province/College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;3.College of Agricultural,Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan 471023,China)

Leymusmollis(Trin.) Pilger(NsNsXmXm,2n=28),an excellent germplasm resource for wheat improvement,possesses many potentially valuable traits,such as strong stems,large spikes,multiple spikelets,tolerance of abiotic stresses and resistance to fungal and bacterial diseases. In this study,an addition and translocation line DM 5911 with the chromosome number of 2n=44 was developed from the F6progeny of octoploidTritileymusM 842-16 ×Triticumdurumcv. D 4286 by using of cytogenetics and morphology. Screening of mitosis and meiosis showed that DM 5911 had a chromosome karyotype of 2n=44=22Ⅱ. Mitosis GISH(genomicinsituhybridization) indicated that DM 5911 contains two whole Ns chromosomes and two translocation chromosomes between wheat andL.mollisNs genome. Meiosis GISH indicated that theL.mollisNs chromosomes perform normal synapsis,pairing and inheritance. The results suggested that DM 5911 is a cytogenetically stable wheat-L.mollisaddition and translocation line,containing a pair of whole Ns chromosome and a pair of Ns translocated into wheat chromosomes. Morphology investigation showed that DM 5911 has improved in the agronomic traits,such as plant height and the number of tillers.This line can be used as a new germplasm for creating translocation line with small chromosome fragment in wheat chromosome engineering and genetic breeding.

Wheat;Leymusmollis; Addition; Translocation; Genomicinsituhybridization(GISH)

2016-03-08

2016-03-30

陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015JM3095); 西北農(nóng)林科技大學(xué)唐仲英育種基金項(xiàng)目

E-mail：cxn622@126.com

趙繼新(E-mail:zhjx881@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)08-0996-07

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-08-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160801.1120.008.html