袁振亞 袁牧 黃曉潔 嚴(yán)為巧 宋雪梅

平衡易位是一類常見結(jié)構(gòu)異常染色體疾病，在新生兒中的發(fā)生率約為0.2%，在反復(fù)妊娠丟失人群中的發(fā)生率達(dá)到了5%～10%[1-5]。羅氏易位是平衡易位的一種特殊形式。平衡易位攜帶者產(chǎn)生染色體不平衡配子的概率很高，可能會出現(xiàn)不孕、胚胎停止發(fā)育、反復(fù)自然流產(chǎn)或出生缺陷，給患者帶來痛苦和經(jīng)濟(jì)壓力[6-7]。胚胎植入前遺傳學(xué)檢測（pre-implantation genetic testing，PGT）技術(shù)可在孕前對胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)檢測，篩選整倍體胚胎進(jìn)行移植，可有效降低易位攜帶者夫婦的妊娠風(fēng)險[8]。本研究對50 對平衡易位和羅氏易位攜帶者的PGT 周期進(jìn)行研究，深入分析攜帶者夫婦PGT 周期的臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，探究平衡易位攜帶者子代胚胎的遺傳學(xué)特征，為平衡易位攜帶者的個性化診療策略及遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年1 月—2021 年12 月在徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心就診并接受PGT 周期治療的50 對患者夫婦，每對夫婦其中一方經(jīng)染色體核型分析確診為染色體平衡易位或羅氏易位攜帶者。羅氏易位有17 對夫婦，共完成19 個PGT 周期，納入羅氏易位組；平衡易位共33 對夫婦，共完成42 個PGT周期，納入平衡易位組。所有夫婦均簽署了相關(guān)知情同意書。PGT 及等位基因映射識別胚胎易位狀態(tài)（mapping allele with resolved carrier state，MaReCs）技術(shù)項(xiàng)目的開展通過了徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會的審查（PGT 批件號：[2018]生殖倫審第（03）號；MaReCs 意見號：XFYJL-2017-02）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）夫妻中有一方明確診斷為染色體平衡易位/ 羅氏易位攜帶者。（2）患者沒有體外受精-胚胎移植的禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）復(fù)雜易位、夫妻雙方同時存在染色體結(jié)構(gòu)異常。（2）具有體外受精-胚胎移植的禁忌證。（3）女方患有影響胚胎著床的相關(guān)疾病。（4）其他不適合接受輔助生殖技術(shù)的情況。

1.2 方法

使用長方案或拮抗劑方案進(jìn)行超排卵，采用單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射（intra cytoplasmic sperm injection，ICSI）完成受精，使用時差培養(yǎng)系統(tǒng)（Vitrolife，瑞典）進(jìn)行胚胎培養(yǎng)，參照Gardner 囊胚分級標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行評分，對評級為4BC 或4CB 及以上的囊胚進(jìn)行外滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢。使用二代測序平臺（Illumina，美國）對活檢產(chǎn)物進(jìn)行PGT 檢測，篩選出整倍體胚胎后，結(jié)合胚胎動態(tài)發(fā)育情況和形態(tài)學(xué)評分綜合進(jìn)行二次篩選，擇優(yōu)進(jìn)行移植。對要求鑒別易位攜帶狀態(tài)胚胎的夫婦，在PGT 檢測完成后進(jìn)行MaReCs，選擇正常核型胚胎進(jìn)行移植。移植后定期進(jìn)行B 超檢查和隨訪，孕中期進(jìn)行羊水穿刺術(shù)，檢測胎兒的染色體核型。

1.3 觀察指標(biāo)

對羅氏易位組與平衡易位組男方年齡、女方年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平：卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、雌二醇（estradiol，E2）、孕激素（progestin，P）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、抗苗勒氏管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）、竇卵泡數(shù)（antral follicle counting，AFC）、D0 獲卵總數(shù)、MII 數(shù)、2PN 數(shù)、D3 優(yōu)胚數(shù)、囊胚形成數(shù)、活檢囊胚數(shù)、整倍體率、非整倍體率、易位相關(guān)異常胚胎占非整倍體的比率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料男方年齡、女方年齡、BMI、基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平（FSH、E2、P、LH、AMH）、AFC、D0獲卵總數(shù)、MII 數(shù)、2PN 數(shù)、D3 優(yōu)胚數(shù)、囊胚形成數(shù)、活檢囊胚數(shù)以M（P25，P75）表示，行Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料整倍體率、非整倍體率、易位相關(guān)異常胚胎占非整倍體的比率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率以n（%）表示，對整倍體率、非整倍體率、易位相關(guān)異常胚胎占非整倍體的比率行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較與體外受精結(jié)果

羅氏易位和平衡易位組患者女方年齡、男方年齡、BMI、基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平（FSH、E2、P、LH、AMH）、AFC 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性，見表1。

表1 平衡易位/羅氏易位攜帶者臨床信息比較 M（P25，P75）

表1 （續(xù)）

羅氏易位組和平衡易位組獲卵總數(shù)、MII 卵數(shù)、2PN 數(shù)、D3 優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、形成囊胚數(shù)、活檢囊胚數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 平衡易位/羅氏易位攜帶者實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù) M（P25，P75）

2.2 PGT 與MaReCs 結(jié)果

2.2.1 兩組整倍體率、非整倍體率及易位相關(guān)異常占比情況 羅氏易位組共活檢了100 個囊胚，其中整倍體64 個，非整倍體26 個，嵌合體10 個。平衡易位組共活檢了159 個囊胚，其中整倍體50 個，非整倍體98 個，嵌合體11 個。PGT 結(jié)果顯示，羅氏易位組整倍體率顯著高于平衡易位組，非整倍體率顯著低于平衡易位組，且羅氏易位組非整倍體囊胚中，易位相關(guān)異常占比顯著低于平衡易位組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組整倍體率、非整倍體率及易位相關(guān)異常占比情況

2.2.2 平衡易位/羅氏易位攜帶者核型分析情況 在19 個羅氏易位PGT 周期中，4 周期是女方羅氏易位，15 周期為男方羅氏易位；13 周期要求進(jìn)行MaReCs，其中5 周期的易位染色體遺傳自母親，3 周期遺傳自父親，5 周期為新發(fā)型易位；6周期不要求MaReCs，攜帶者父母未進(jìn)行染色體核型分析。在42 個平衡易位PGT 周期中，22 周期是女方平衡易位，20 周期為男方平衡易位；26 周期要求進(jìn)行MaReCs，其中4 周期的易位染色體遺傳自母親，9 周期遺傳自父親，13 周期為新發(fā)型易位；16周期不要求MaReCs，攜帶者父母未進(jìn)行染色體核型分析，見表3。

表3 平衡易位/羅氏易位攜帶者核型分析情況

2.2.3 平衡易位/羅氏易位MaReCs 情況統(tǒng)計(jì) 羅氏易位組有12 個周期成功完成MaReCs，包括8 個遺傳型和4 個新發(fā)型周期。1 個周期識別失敗原因?yàn)椋盒掳l(fā)型易位，且當(dāng)次周期沒有足夠的易位相關(guān)異常胚胎。平衡易位組13 個周期成功完成MaReCs，包括8 個遺傳型和5 個新發(fā)型周期。有13 個周期識別失敗，原因?yàn)椋浩渲? 個新發(fā)型和5 個遺傳型周期已完成易位染色體SNP 單體型構(gòu)建，但當(dāng)次周期沒有整倍體胚胎，無法區(qū)分；2 個新發(fā)型周期當(dāng)次無易位相關(guān)異常胚胎，且無整倍體胚胎；1 個新發(fā)型周期雖然當(dāng)次有1 個整倍體胚胎但無易位相關(guān)異常胚胎，無法區(qū)分，見表4。

表4 平衡易位/羅氏易位進(jìn)行MaReCs 情況統(tǒng)計(jì)

2.3 移植結(jié)局

目前，已有15 對羅氏易位攜帶者夫婦和18 對平衡易位攜帶者夫婦獲得了單個整倍體囊胚的移植。羅氏易位組中，進(jìn)行MaReCs 的9 例接受了正常核型囊胚，未進(jìn)行MaReCs 的6 例接受了整倍體囊胚移植。有13 例獲得了宮內(nèi)妊娠，臨床妊娠率達(dá)到了86.67%（13/15），11 例順利分娩，活產(chǎn)率為73.33%（11/15），流產(chǎn)率為15.38%（2/13），產(chǎn)前診斷結(jié)果與PGT 結(jié)果一致，侵入性產(chǎn)前診斷率達(dá)到100%。

平衡易位組中，進(jìn)行MaReCs 的10 例接受了正常核型囊胚移植，未進(jìn)行MaReCs 的8 例接受了整倍體囊胚移植。有15 例獲得了宮內(nèi)妊娠，臨床妊娠率達(dá)到了83.33%（15/18），13 例順利分娩，活產(chǎn)率為72.22%（13/18），流產(chǎn)率為13.33%（2/15），產(chǎn)前診斷結(jié)果與PGT 結(jié)果一致，侵入性產(chǎn)前診斷率達(dá)到100%。

3 討論

染色體平衡易位是導(dǎo)致不良妊娠的主要遺傳學(xué)因素之一[10-11]。因此，雖然羅氏易位和平衡易位夫婦有機(jī)會生育正常表型子代，但往往面臨著極大的妊娠風(fēng)險，同時易位染色體有幾率向后代遺傳，易位攜帶核型的子代到了育齡期，將面臨和親代同樣的生育困擾。

本研究嚴(yán)格遵循了2018 年《胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查技術(shù)專家共識》規(guī)定的相關(guān)臨床執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[12]。通過對羅氏易位和平衡易位攜帶者61 個PGT 周期進(jìn)行了分析，積累了一定的臨床經(jīng)驗(yàn)。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，羅氏易位和平衡易位通過PGT 周期獲得可移植囊胚的概率為20%～60%[5，8，10]。本研究顯示羅氏易位和平衡易位攜帶者分別可獲得64.00%和31.45%整倍體率，與其他同類研究結(jié)果相近。羅氏易位和平衡易位組移植后的臨床妊娠率分別達(dá)到了86.67%和83.33%，且產(chǎn)前診斷與PGT 結(jié)果均一致，活產(chǎn)率分別達(dá)到了73.33%或72.22%，證明PGT 技術(shù)可顯著提高羅氏易位和平衡易位攜帶者妊娠率，降低流產(chǎn)率，提高活產(chǎn)率[10，13-14]。

在遺傳咨詢過程中，有68.42%（13/19）的羅氏易位攜帶者和61.90%（26/42）的周期患者要求在PGT 后加做MaReCs，以期獲得核型正常的胚胎移植，徹底阻斷易位染色體在家族中的傳遞。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于羅氏易位攜帶者，平衡易位攜帶者子代胚胎有較低的整倍體率和較高的非整倍體率，且由易位導(dǎo)致的染色體不平衡胚胎占比較高。通過首次PGT 周期獲取的NGS 信息，即可完成92.31% 羅氏易位和88.46%平衡易位染色體SNP 單體型的構(gòu)建，構(gòu)建失敗的原因均為新發(fā)型易位且當(dāng)前PGT 周期沒有易位相關(guān)異常胚胎。部分平衡易位攜帶者PGT 周期面臨著可活檢胚胎數(shù)少、沒有可用胚胎、無法進(jìn)行MaReCs 的處境，多次促排卵可能是解決這一問題的有效方法之一。臨床上采取靈活、個性化的策略來保證易位染色體SNP 單體型構(gòu)建成功率：對于遺傳性易位，可使用攜帶者及其父母外周血NGS 信息構(gòu)建易位染色體SNP 單體型。對于新發(fā)型易位，可采用易位相關(guān)異常胚胎輔助完成構(gòu)建。如果是男性易位攜帶者，還可以采集精子，尋找易位相關(guān)異常的精子輔助完成構(gòu)建[15]。對于卵巢儲備差、經(jīng)濟(jì)壓力大等無法進(jìn)行下一PGT 周期的患者，可在充分知情同意后，收集正常受精但未達(dá)到活檢標(biāo)準(zhǔn)的廢棄胚胎進(jìn)行檢測，輔助完成易位染色體SNP單體型的構(gòu)建。對于女性易位攜帶者，可以通過極體活檢的方法獲得相關(guān)遺傳學(xué)信息。但是，由于女性攜帶者卵子較珍貴，且臨床上對第二極體的活檢時間難以把握，活檢要求高，對于胚胎發(fā)育的影響無法預(yù)測，因此極體活檢并未得到廣泛的臨床應(yīng)用。

PGT 技術(shù)的出現(xiàn)給平衡易位攜帶者帶來了生育的希望。雖然可為平衡易位的輔助生殖治療策略提供一定的指導(dǎo)依據(jù)，對患者的知情選擇具有參考價值，但本研究仍有一定的局限性。染色體平衡易位的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，患者在各個環(huán)節(jié)上的個體化的差異加劇了深入探究和分析平衡易位攜帶者PGT 周期胚胎遺傳學(xué)特征的難度，仍需多中心參與、更大的樣本量進(jìn)行更細(xì)致的研討，以期獲得更多的經(jīng)驗(yàn)和策略服務(wù)于臨床診療。