王圣巖

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117）

研究中最早發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位方式是依靠信號識別顆粒（signal recognition particle,SRP）的共翻譯易位（co-translational translocation）。在共翻譯易位中，蛋白先在核糖體上翻譯出信號序列，通過信號序列的疏水性與細(xì)胞質(zhì)中的SRP結(jié)合，翻譯暫停。SRP牽引核糖體蛋白質(zhì)復(fù)合物向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的SRP受體結(jié)合，核糖體結(jié)合在Sec61上，翻譯繼續(xù)，最終將蛋白質(zhì)引導(dǎo)至Sec61通道中[1-4]。在酵母中的研究發(fā)現(xiàn)，共翻譯易位方式只占了全部分泌蛋白的43.3%；還有56.7%的蛋白運(yùn)輸并不依靠SRP[5]，比如錨定蛋白和比較短的分泌蛋白則需要另一種途徑完成轉(zhuǎn)運(yùn)，即翻譯后易位（posttranslational translocation）途徑。參與翻譯后易位的蛋白其信號序列疏水性不足或長度不夠，不能被細(xì)胞質(zhì)中的SRP識別，所以它們需要另一種分子伴侶引導(dǎo)蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。在真核生物中，分泌蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)是蛋白質(zhì)分泌初始階段的關(guān)鍵步驟，如果這個過程出現(xiàn)錯誤，蛋白質(zhì)穩(wěn)定會被破壞甚至導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙[6]。為了更好地了解翻譯后易位，本文對翻譯后易位的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了綜述，同時也描述了Sec復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能。

1 翻譯后易位途徑

分泌蛋白質(zhì)是生物體進(jìn)行生命活動的重要組成部分，而這些蛋白質(zhì)想要發(fā)揮功能就需要進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行進(jìn)一步加工。根據(jù)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)方式的不同，轉(zhuǎn)運(yùn)方式分為共翻譯易位和翻譯后易位。這兩種方式的區(qū)別主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)翻譯的時機(jī)和靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)方式的不同。真核生物中細(xì)胞器被膜分隔成獨(dú)立的區(qū)域，蛋白質(zhì)前體合成后需要進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的存在，從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)需要有分泌信號通路（general secreation pathway,Sec）的參與，進(jìn)而再運(yùn)輸?shù)教囟ǖ膮^(qū)域發(fā)揮功能，這就需要蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中精準(zhǔn)靶向[6]。翻譯后易位途徑可分為三個步驟：第一步是多肽鏈在細(xì)胞質(zhì)中通過核糖體完成合成，然后細(xì)胞質(zhì)中的分子伴侶結(jié)合到多肽鏈上將其引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上；第二步是多肽鏈N短的信號序列進(jìn)入Sec通道，在其它Sec蛋白的幫助下通道擴(kuò)大，信號序列在通道內(nèi)切割并從通道側(cè)面釋放；第三步是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)部的分子伴侶將多肽鏈拉入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里面進(jìn)行加工折疊[7]（圖1）。

圖1 翻譯后易位途徑

2 翻譯后易位復(fù)合物組成和結(jié)構(gòu)

翻譯后易位機(jī)制復(fù)雜，需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上多種復(fù)合物及細(xì)胞質(zhì)中和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)分子伴侶的參與。在翻譯后易位過程中，分泌蛋白依然是通過Sec61通道進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但額外需要Sec62-Sec63復(fù)合物的輔助。酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上Sec復(fù)合物組成如圖1所示，這些復(fù)合物相互作用，共同完成翻譯后易位過程。翻譯后易位復(fù)合物在酵母、人和小鼠中名稱有所差別（表1）。

表1 參與翻譯后易位的Sec復(fù)合物

Sec61 復(fù)合物是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中的關(guān)鍵元件，形成一個內(nèi)部疏水的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通道[8]。Sec61轉(zhuǎn)運(yùn)通道由三個亞基構(gòu)成，分別是Sec61p、Sss1和Sbh1。Sec61p是最主要的亞基，也是最大的亞基，它包含十個跨膜螺旋（transmembrane helices,TM），呈沙漏狀，多肽就是通過這個通道轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)[9]。Sec61p有兩個較大的環(huán)L6和L8，它們位于細(xì)胞質(zhì)面，是在共翻譯易位期間核糖體的結(jié)合位點(diǎn)。Sss1和Sbh1體積較小，附著在Sec61p周圍并與之產(chǎn)生聯(lián)系。在閑置狀態(tài)下，轉(zhuǎn)運(yùn)通道被一個閥塞結(jié)構(gòu)域堵住，這個結(jié)構(gòu)域由第一個跨膜螺旋（TM1）之后的片段形成，在蛋白質(zhì)開始易位時這個結(jié)構(gòu)會移開，從而使通道打開[10-12]。這個通道還包含一個側(cè)門（lateral gate），由TM2和TM7構(gòu)成，可以將多肽釋放到脂質(zhì)相中，并且信號序列被切割之后將從此處被釋放[9]，側(cè)門的打開是可溶性分泌蛋白疏水性信號序列的識別和跨膜蛋白整合所必需的。Sec61p開放與關(guān)閉狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)已被解析，具體結(jié)構(gòu)特征可參考Voorhees等人的研究工作[10]。

Sec62 由一個球狀的N末端、C末端和兩個跨膜螺旋（TM1、TM2）組成，N末端和C末端均位于細(xì)胞質(zhì)中，兩個跨膜螺旋被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)一個短的環(huán)連接，Sec62整體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)“V”字型[9]。Sec62與Sec61p主要是以Sec62-TM1和Sec61p-TM3、N末端接觸。在Sec62-TM2之后存在一個平躺在膜上的橢圓形結(jié)構(gòu)域，稱為錨定區(qū)域。這個區(qū)域富含疏水性，在釀酒酵母中對其中疏水性殘基進(jìn)行單點(diǎn)突變不會導(dǎo)致生長缺陷，但在215-220位中進(jìn)行三個連續(xù)的突變就會致死，說明疏水性的降低會終止其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的相互作用，這個錨定區(qū)域的功能是將Sec62正確定位在Sec61上[9]。

Sec63 由三個跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，在細(xì)胞質(zhì)面有一個FN3結(jié)構(gòu)域并且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)含有一個J結(jié)構(gòu)域[13]。與Sec63緊密相關(guān)的Sec71（也被稱為Sec66、Hss1）和Sec72（也被稱為Sec67、Sim2）最初是從調(diào)節(jié)膜蛋白轉(zhuǎn)位缺陷的酵母遺傳機(jī)制中篩選出來的[14]。Sec71是一種單跨膜蛋白，含有三個α螺旋其中兩個在N末端構(gòu)成Sec71的底部，C末端帶有一個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。Sec72是一種外周膜蛋白，由一個帶有TPR（tetratricopeptide repeat）結(jié)構(gòu)域的C末端和一個于Sec71相互作用的N末端結(jié)構(gòu)與構(gòu)成[15-17]。這兩個亞基通常以Sec71-Sec72復(fù)合體出現(xiàn)， Sec71整合到Sec復(fù)合物上需要Sec72的存在，而Sec71又對Sec72在體內(nèi)的穩(wěn)定性至關(guān)重要[15]。Sec71-Sec72復(fù)合體僅由各自的一條肽鏈進(jìn)行連接，在Sec71中只需要胞質(zhì)端的結(jié)構(gòu)域就可滿足連接的需要[17]。此外，TPR結(jié)構(gòu)域會與細(xì)胞質(zhì)中的分子伴侶Ssa1和Ssb1相互作用，分別將翻譯后易位蛋白和共翻譯易位蛋白募集到Sec71-Sec72復(fù)合物上[17]。

3 翻譯后易位的調(diào)控機(jī)制

參與翻譯后易位的蛋白主要是錨定蛋白和分泌蛋白。錨定蛋白帶有一個疏水性的跨膜區(qū)，跨膜區(qū)會引導(dǎo)蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位[18]。最早被發(fā)現(xiàn)的與錨定蛋白翻譯后易位相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)因子是信號識別顆粒，所以有可能存在一種與共翻譯途徑相關(guān)的翻譯后SRP依賴性轉(zhuǎn)位途徑[6]。分泌蛋白，例如酵母中的PpαF能夠有效的證明翻譯后易位的存在[19,20]。分泌蛋白的信號序列沒有足夠的疏水性來與SRP進(jìn)行有效的結(jié)合[21]，所以在轉(zhuǎn)位的過程中需要細(xì)胞質(zhì)中的分子伴侶來促進(jìn)蛋白的易位，例如酵母中的Hsp (heat shock protein)70、Hsp40等。Hsp70并不是單獨(dú)發(fā)揮功能，而是需要各種輔助因子，例如J-蛋白（Hsp40），J-蛋白會與未折疊的蛋白進(jìn)行初步結(jié)合并將其傳遞到Hsp70[22]，進(jìn)而防止蛋白折疊和聚集。Hsp70中有一個Ssa1蛋白與翻譯后易位相關(guān)，其可以通過C末端與Sec72的TRP結(jié)構(gòu)域相互作用[17]，翻譯后易位蛋白便可以通過Ssa1到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。

在翻譯后易位的初始階段，多肽N端進(jìn)入Sec61復(fù)合物的易位通道，N端的信號序列必須與信號肽酶結(jié)合被切割分離，但翻譯后易位信號序列被切割的時機(jī)仍不清楚。Sec62有時會在信號序列切割的環(huán)節(jié)中造成一些影響，比如它會阻止信號序列從易位通道側(cè)門的釋放或者阻止信號肽酶對與切割位點(diǎn)的結(jié)合，正常情況下Sec62-TM2與Sec61-TM7會改變原來的構(gòu)象，兩者之間產(chǎn)生空隙從而釋放被切割的信號序列[9]。同時，Sec62可以形成一道屏障來防止脂質(zhì)通過打開的通道側(cè)門滲透到易位通道的內(nèi)部，脂質(zhì)的滲透可能會通過競爭性抑制多肽進(jìn)入通道從而影響蛋白質(zhì)易位[9]。近二十年的一些研究中發(fā)現(xiàn)了Sec62在翻譯后易位中的作用，但Sec62在蛋白質(zhì)易位過程中的詳細(xì)功能仍然是不能完全確定的，Lakkaraju等人發(fā)現(xiàn)由不多于100個氨基酸組成和部分由120-160個氨基酸組成的翻譯后易位蛋白的前體會依賴Sec62進(jìn)行有效轉(zhuǎn)運(yùn)[23]。在Lang等人的一項(xiàng)研究中，Sec62的沉默會導(dǎo)致小的分泌蛋白通過翻譯后易位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的效率降低，但不會影響共翻譯易位和錨定蛋白翻譯后易位膜插入的能力[24]。

多肽鏈的進(jìn)入Sec61通道后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的分子伴侶，如BiP，可以起到引導(dǎo)作用，保證新生蛋白質(zhì)通過易位通道單向運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中。為了促進(jìn)這些分子伴侶與轉(zhuǎn)運(yùn)中的多肽鏈之間的相互作用，Sec63的J結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了它們之間的相互作用。有研究證明，Sec63與BiP的相互作用在某些易位蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)脑缙陔A段可以有效促進(jìn)其進(jìn)入Sec61通道[25,26]，但并不適用于全部蛋白，所以Sec63在轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中的特異性還有待研究[14]。

無論是在體內(nèi)還是體外，Sec62和Sec63的突變對不依賴于SRP的翻譯后易位蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)有影響，而對依賴SRP轉(zhuǎn)運(yùn)的共翻譯易位并無影響，說明了蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)方式是由信號序列影響的[13]。在翻譯后易位中，Sec62-Sec63復(fù)合物與Sec61復(fù)合物的相互作用會使得通道側(cè)門的開口更大[27,28]，而共翻譯易位中核糖體打開的側(cè)門開口會小的多[28,29]。Sec63位于Sec61通道側(cè)門的對面，與通道側(cè)門的開放程度有關(guān)，Sec63敲除之后側(cè)門開口會縮小，雖然Sbh1也處于側(cè)門附近，但它對開口的影響不大[13]。Sec63不僅能打開側(cè)門還可以激活Sec61通道進(jìn)行易位，最近的一項(xiàng)研究也為真核生物中Sec62和Sec63如何激活Sec61通道進(jìn)行翻譯后蛋白質(zhì)易位提供了一個比較詳細(xì)的研究模型[9]。Sec63通過兩個部分與Sec61接觸：一個是通過Sec61-TM3固定在Sec61復(fù)合物上；另一個是通過TM3附近在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的短片段和Sec63N末端與Sec61通道相互作用[9]。Sec63是通過細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中結(jié)構(gòu)域的雙重作用下打開Sec61側(cè)門的。Sec62可以激活Sec61通道，但其與處于關(guān)閉狀態(tài)下的側(cè)門的結(jié)構(gòu)是不兼容的，所以在Sec62激活蛋白質(zhì)易位通道之前必須先由Sec63將側(cè)門打開[9]。

Sec72 與細(xì)胞質(zhì)中的分子伴侶 Ssa1、Ssb1在蛋白質(zhì)易位中發(fā)生作用，無論共翻譯易位蛋白還是翻譯后易位蛋白都會被募集到Sec71-Sec72復(fù)合體上，這改變了之前認(rèn)為只有共翻譯易位才存在靶向過程的認(rèn)知，說明了熱休克蛋白分子不僅僅是讓多肽保持未折疊狀態(tài)，且能夠?qū)Ψg后易位蛋白進(jìn)行靶向[30,31]。在翻譯后易位中由Hsp70與免疫球蛋白BiP（酵母中稱為Kar2）提供多肽鏈的易位動力，BiP被認(rèn)為是通過與肽鏈的結(jié)合來催化蛋白質(zhì)通過Sec61通道，并且能夠防止多肽鏈反向移動到細(xì)胞質(zhì)中[32]。

4 未來與展望

在對翻譯后易位的研究中揭示了蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位的復(fù)雜過程，這個過程需要細(xì)胞質(zhì)因子、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)分子伴侶的共同作用。對翻譯后易位的研究具有重大意義，尤其是在外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)中，隨著翻譯后易位途徑的調(diào)控機(jī)制被揭示，外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)對分泌蛋白的表達(dá)量或許可以高出原來的幾倍，這無疑是外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)的一個巨大潛力。但目前對翻譯后易位的分子機(jī)理的研究還不夠全面，在蛋白質(zhì)易位的過程中或許還涉及其他尚未發(fā)現(xiàn)的成分。Sec復(fù)合物對生命體是不可或缺的，但其每一步構(gòu)象變化的時機(jī)和識別機(jī)制還有待充分探索。