羅燕群 李輝斌 黃翠玉 黃莉 朱秀蘭 張曦倩 劉風(fēng)華

(廣東省婦幼保健院 生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州 511442)

隨著年齡增加卵子質(zhì)量下降，非整倍體率增加[1,2]，故高齡成為胚胎植入前非整倍性基因測(cè)試(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)的臨床指征之一。除了高齡是非整倍體發(fā)生的高危因素，另外也有基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠的卵母細(xì)胞顯示減數(shù)分裂異?；蜓舆t[3]，高脂飲食小鼠的卵母細(xì)胞表現(xiàn)出紡錘體缺陷，染色體錯(cuò)位和非整倍性發(fā)生率更高[4]。因此，近年來(lái)體重的改變對(duì)生殖的影響也備受關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)超重和肥胖患者其內(nèi)分泌以及代謝的改變導(dǎo)致不孕癥、自然流產(chǎn)、體外受精-胚胎移植助孕不良的妊娠結(jié)局以及產(chǎn)科并發(fā)癥增加[5-9]。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)隨著身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)增加，體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)助孕低反應(yīng)周期取消率增加，妊娠率降低，但是在接收贈(zèng)卵的肥胖受體的薈萃分析發(fā)現(xiàn)BMI增加不會(huì)影響IVF-ET結(jié)局，表明卵母細(xì)胞質(zhì)量是影響肥胖患者IVF/ICSI結(jié)局的關(guān)鍵因素[10, 11]。但是臨床上婦女體重的異常是否會(huì)引起胚胎非整倍體率增加導(dǎo)致妊娠率降低？目前此方面研究尚少，本研究先通過(guò)分析反復(fù)種植失敗不同年齡組以及不同體重指數(shù)組患者的非整倍體率的差異，再進(jìn)一步在不同年齡段分層分析不同體重指數(shù)患者的非整倍體率的情況，希望給反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕前的遺傳咨詢提供有用的信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2017年5月至2020年6月在廣東省婦幼保健院診斷為反復(fù)種植失敗行PGT-A的79個(gè)周期資料。入選標(biāo)準(zhǔn)：①取卵年齡≤39周歲；②診斷為反復(fù)種植失敗的患者，即既往至少3次或以上移植周期(包括新鮮或者凍融胚胎)，累積移植大于等于4個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎；③均為新鮮PGT-A周期。排除標(biāo)準(zhǔn)：①男女雙方染色體核型異常；②輸卵管積水；③子宮畸形；④中、重子宮粘連的電切術(shù)后；⑤女方抗心磷脂抗體陽(yáng)性或者凝血功能異常。廣東省婦幼保健院的倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)本研究，參與患者均知情并簽署同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 分組 按取卵年齡分<35歲組和35～39歲組，按BMI分體重過(guò)低組(<18.5kg/m2)、正常組(18.5～23.9kg/m2)和超重組(24.0～27.9kg/m2)[12, 13]。

1.2.2 控制性促排卵以及PGT-A胚胎培養(yǎng)和活檢 采用常規(guī)的促排卵方案，當(dāng)1個(gè)卵泡直徑≥20mm或者3個(gè)以上卵泡直徑≥18 mm時(shí)，注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)6000～10 000U誘導(dǎo)排卵，誘發(fā)排卵后36h取卵。取卵后4～6h常規(guī)行卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，然后采用序貫培養(yǎng)(vitrolife G-series)胚胎至第5天或第6天，活檢時(shí)間為受精后第5或第6天，活檢部分外胚層細(xì)胞(5～10個(gè))送檢?；顧z后的囊胚常規(guī)冷凍保存。

1.2.3 PGT-A檢測(cè) 利用胚胎植入前染色體非整倍體檢測(cè)的試劑盒(可逆末端終止測(cè)序法)進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)(嘉寶仁和，北京)，再采用SurePlex擴(kuò)增的試劑盒(Rubicon 公司，美國(guó))對(duì)常規(guī)活檢的5～10個(gè)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，然后通過(guò)基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序(copy number variation sequencing，CNV-seq)分析方法對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)以及數(shù)據(jù)分析[14]。

1.2.4 PGT-A胚胎檢測(cè)數(shù)據(jù)分析以及判讀標(biāo)準(zhǔn) 整倍體囊胚檢測(cè)結(jié)果中沒(méi)有出現(xiàn)整條染色體異常和片段性異常(>4 Mb)及嵌合情況。非整倍體囊胚：當(dāng)23對(duì)染色體中任意一條染色體檢測(cè)結(jié)果與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)的正常染色體存在顯著差異，即該條染色體拷貝數(shù)異常(包括嵌合情況)。整倍體數(shù)=診斷囊胚數(shù)-非整倍體數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 ≤35歲和35～39歲反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕的臨床特征以及非整倍體的比較 <35歲患者的BMI、腰圍、腰臀比、抗苗勒管激素、成熟卵數(shù)、囊胚形成數(shù)、活檢囊胚數(shù)、嵌合體率均和35～39歲患者間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但胚胎整倍體數(shù)、整倍體率明顯高于35～39歲患者(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 <35歲和35～39歲患者的臨床特征和非整倍體比較

2.2 不同體重指數(shù)的反復(fù)種植失敗患者行PGT-A助孕的臨床特征以及非整倍體的比較 不同BMI組間(<18.5、18.5～23.9和24.0～27.9)患者的年齡、基礎(chǔ)FSH、抗苗勒管激素、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、2PN卵裂數(shù)、活檢囊胚數(shù)間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，體重指數(shù)18.5～24.0組患者正常受精率、囊胚形成率明顯高于其他2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但是其胚胎整倍體數(shù)、整倍體率和嵌合體率三組間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同BMI患者的臨床特征和非整倍體的比較

2.3 小于35歲和35～39歲不同體重指數(shù)的反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕的臨床特征以及非整倍體的比較 不同年齡段(年齡<35歲和34～39歲)患者分別統(tǒng)計(jì)不同體重指數(shù)組間(<18.5kg/m2、18.5～23.9kg/m2和24.0～27.9kg/m2)患者的年齡、活檢囊胚數(shù)、胚胎整倍體數(shù)、整倍體率和嵌合體率3組間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。35～39歲年齡階段的患者體重正?；颊吣遗咝纬陕矢哂隗w重過(guò)低和超重患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 ≤34歲和35～39歲不同BMI患者的臨床特征和非整倍體的比較

3 討論

肥胖不僅導(dǎo)致心血管和腦血管疾病、糖尿病、睡眠呼吸暫停、關(guān)節(jié)炎和癌癥等風(fēng)險(xiǎn)增加[15, 16]，而且影響女性的生殖功能，超重同樣產(chǎn)生不良影響。國(guó)外研究分析了超重或肥胖對(duì)IVF/ICSI助孕結(jié)果的影響提示即使 BMI ≥25kg/m2也與IVF/ICSI治療的妊娠率降低和自然流產(chǎn)率增高有關(guān)[6][11, 17]，以及超重導(dǎo)致種植率明顯降低[18]。也有針對(duì)35歲以下IVF助孕患者的研究發(fā)現(xiàn)肥胖影響胚胎質(zhì)量[19]。非整倍體是自然流產(chǎn)以及反復(fù)種植失敗發(fā)生的主要原因之一[20]。隨著年齡的增加非整倍體率增加，2018版的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查技術(shù)專家共識(shí)提出高齡≥38歲、不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)以及不明原因反復(fù)種植失敗婦女建議行PGS(即PGT-A)助孕篩查整倍體胚胎移植[21]。反復(fù)種植失敗患者中年齡和非整倍體的關(guān)系如何？BMI的異常與非整倍體的發(fā)生是否相關(guān)？本研究針對(duì)性先分析了反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕<35歲和≥35～39歲患者非整倍體率的差異，再進(jìn)一步分析不同體重指數(shù)患者非整倍體的差異。

3.1 不同年齡段反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕非整倍體的分析 由于導(dǎo)致不明原因性反復(fù)種植失敗的機(jī)制復(fù)雜，PGT-A篩選整倍體胚胎移植以及提高子宮內(nèi)膜容受性均認(rèn)為是其治療的主要措施，但如何針對(duì)予以行之有效的措施尚有爭(zhēng)議,尤其近期對(duì)PGT-A的臨床意義提出了新的質(zhì)疑以及其指征也面臨修改和更新[21-24]。遭遇不明原因性反復(fù)種植失敗的患者選擇行PGT-A助孕的利弊如何？國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)<35歲、35～37歲、38～39歲和40歲以上囊胚非整倍體的概率分別為40.3%、50.8%、56%和78.3%[2, 25]。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)針對(duì)不同年齡組女性胚胎的非整倍性情況分析發(fā)現(xiàn)>35歲的高齡女性胚胎染色體異常率高于低齡女性[26]，本研究與上述研究一致，我們針對(duì)反復(fù)種植失敗PGT-A助孕患者研究發(fā)現(xiàn)<35歲和35～39歲組的囊胚形成率相似，但是整倍體率差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為61.1%和47.0%。因此，遺傳咨詢時(shí)，針對(duì)性提供患者相應(yīng)年齡段囊胚可能獲得整倍體胚胎的概率，可給患者選擇是否行胚胎植入前遺傳學(xué)篩查提供幫助。

2.2 不同體重指數(shù)反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕非整倍體的分析 國(guó)外研究結(jié)果提示超重或肥胖對(duì)生殖系統(tǒng)的不良影響可能與胚胎非整倍性無(wú)關(guān)[12]。由于國(guó)外與國(guó)內(nèi)人種的不同，同時(shí)肥胖以及超重的診斷標(biāo)準(zhǔn)和發(fā)生概率也有差異，因此我們也針對(duì)體重指數(shù)與非整倍體的關(guān)系進(jìn)行研究。但由于地理位置關(guān)系，本中心就診的中國(guó)南方地區(qū)不孕的肥胖婦女比較少，尤其是因反復(fù)種植失敗行PGT-A的不孕婦女，因此本研究重點(diǎn)探討體重過(guò)低、體重正常和超重的反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕周期非整倍體的差異。本研究中無(wú)論是否以年齡分層分析得出的結(jié)果均與國(guó)外研究一致，認(rèn)為不同BMI組患者的非整倍體率相似。研究證實(shí)卵裂期胚胎的整倍體率是33.3%，明顯低于囊胚的整倍體率60.3%[27]，我們研究發(fā)現(xiàn)35～39歲年齡段的體重正?；颊吣遗咝纬陕拭黠@高于體重過(guò)低和超重患者，分析認(rèn)為囊胚培養(yǎng)過(guò)程中一些發(fā)育潛能差的胚胎(包括一些非整倍體胚胎)被淘汰[28]，與Goldman等[12]研究結(jié)果一致認(rèn)為超重或肥胖對(duì)體外受精-胚胎移植助孕結(jié)果的負(fù)面影響可能是與胚胎非整倍體以外的因素有關(guān)。因此我們研究認(rèn)為雖然體重指數(shù)異?？赡懿挥绊懛钦扼w的發(fā)生，但是35～39歲的反復(fù)種植失敗患者行PGT-A助孕前控制體重指數(shù)至正常范圍可能會(huì)通過(guò)提高囊胚形成率增加整倍體胚胎個(gè)數(shù)。

胚胎非整倍體的發(fā)生與眾多因素相關(guān)，例如產(chǎn)婦年齡，精子質(zhì)量和卵母細(xì)胞的體外操作等[24]，另外本研究為回顧性隊(duì)列分析且樣本量有限等因素可能會(huì)對(duì)非整倍體的統(tǒng)計(jì)分析產(chǎn)生偏倚，因此尚需要設(shè)計(jì)良好的前瞻性隨機(jī)臨床試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述，當(dāng)反復(fù)種植失敗患者年齡增加至35～39歲時(shí)整倍體率明顯降低以及體重指數(shù)的異?？赡苡绊懩遗咝纬陕?。超重以及體重過(guò)低可能不影響反復(fù)種植失敗患者的非整倍體率。