畢志宏，魏敏靜，劉瑩瑩，楊傳平，魏志剛（東北林業(yè)大學(xué) 林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

樣本數(shù)量對白樺群體遺傳參數(shù)估算的影響

畢志宏，魏敏靜，劉瑩瑩，楊傳平，魏志剛
（東北林業(yè)大學(xué) 林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

群體遺傳參數(shù)是群體遺傳學(xué)研究的主要內(nèi)容之一，估算值的大小受群體樣本數(shù)量的影響。以帽兒山試驗林場白樺Betula platyphylla種源試驗林為對象，采用序列相關(guān)擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）技術(shù)分析了種源內(nèi)不同樣本數(shù)量對白樺群體遺傳多樣性的影響。結(jié)果表明：不同樣本數(shù)量對白樺的估算的各遺傳參數(shù)有一定影響，但影響各異。其中，對白樺群體多態(tài)位點百分率、群體內(nèi)遺傳變異和群體間遺傳參數(shù)影響顯著，對總位點數(shù)、多態(tài)位點數(shù)和基因流影響不顯著。樣本數(shù)量對于群體間與群體內(nèi)遺傳變異的大小的研究結(jié)果也產(chǎn)生影響，如樣本數(shù)量超過8個，顯示白樺種源內(nèi)的遺傳變異幅度大于種源間；而樣本數(shù)量為4個，顯示為種源間遺傳變異幅度大于種源內(nèi)。此外，不同樣本數(shù)量揭示出的種源間親緣關(guān)系不同，如樣本數(shù)量超過8個，15個種源的聚類結(jié)果基本一致；而樣本數(shù)量為4個，聚類結(jié)果無法反映白樺群體的親緣關(guān)系。最后，提出了白樺遺傳多樣性研究時樣本數(shù)量的計算公式，認為白樺多態(tài)位點百分率達98.5%的樣本數(shù)量應(yīng)為11個。圖4表3參23

林木遺傳育種學(xué)；白樺；遺傳多樣性；樣本容量

林木種質(zhì)資源是陸地生物的避護所和主基因庫。林木種質(zhì)資源的丟失，將引起鄰近生物種及其種質(zhì)以4～13倍的速率丟失［1］。了解林木群體的遺傳背景、遺傳結(jié)構(gòu)及群體間的親緣關(guān)系，是林木遺傳多樣研究和采取科學(xué)有效措施保護其種質(zhì)資源的前提和基礎(chǔ)［2］，也為林木資源的開發(fā)與利用提供信息。到目前為止，先后采用不同的標(biāo)記技術(shù)對眾多的林木遺傳多樣性進行了研究［3-6］。群體遺傳參數(shù)是群體遺傳學(xué)研究的主要內(nèi)容之一，估算值的大小受群體樣本數(shù)量的影響。林木為異交物種，需要一定的數(shù)量才能代表1個群體，因此群體內(nèi)個體數(shù)量的多少可能對群體遺傳參數(shù)估算產(chǎn)生一定影響。然而，長期以來，在樹木遺傳多樣性研究中，群體內(nèi)個體數(shù)量對遺傳參數(shù)研究結(jié)果的影響研究尚無報道。序列相關(guān)擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）標(biāo)記建立以來，由于其操作簡便、成本低、可信度高、易于測序等特點倍受分子生物學(xué)家的青睞［7］，被迅速應(yīng)用到花生Arachis hypogaea，油菜Brassica napus等植物［8-14］的種質(zhì)資源鑒定評價、遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀標(biāo)記以及基因克隆等方面。白樺Betula platyphylla是一種分布范圍廣、適用性強、用途廣泛的闊葉速生樹種，然而，有關(guān)白樺遺傳多樣性研究中，同樣也沒有重視種源內(nèi)樣本數(shù)量對遺傳參數(shù)估算的影響問題［15］。本研究以東北林業(yè)大學(xué)帽兒山試驗林場15個白樺種源為對象，采用SRAP技術(shù)分析了白樺種源內(nèi)不同樣本數(shù)量對其遺傳多樣性參數(shù)估算的影響，以期確定白樺遺傳多樣性分析的種源內(nèi)個體最優(yōu)數(shù)量，也為其他樹種遺傳多樣性研究提供參考。

1　材料與方法

1.1植物材料

試驗材料來自東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實驗林場內(nèi)白樺種源試驗林，共15個種源，分別為涼水、汪清、新疆、露水河、小北湖、輝南、桓仁、莫爾道嘎、草河口、綽爾、寧夏、清源、東方紅、帽兒山、烏伊嶺。隨機選取個體20個·種源-1，共計300個樣本。2012年6月采取當(dāng)年生嫩葉，用密封袋封好，做好標(biāo)記，放在冰盒中帶回，置于－70℃冰箱中保存，以備提取DNA。

1.2試驗方法

1.2.1白樺葉片基因組DNA提取白樺葉片基因組DNA提取參考文獻［16］。

1.2.2SRAP標(biāo)記分析SRAP反應(yīng)體系為20.00 μL：0.21×106μg·L－1DNA，1.50 μL；25 mmol·L－1Mg2+，1.40 μL；5×16.67 μkat·L－1Taq酶，0.25 μL；2.5 mmol·L－1三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs），2.00 μL；10 μmol·L－1引物，0.35 μL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃延伸7 min。根據(jù)文獻［17］中的引物序列，本研究中所用SRAP引物由上海生工合成。從親緣關(guān)系最近的2個種源（莫爾道嘎和桓仁）中分別選5個個體用于多態(tài)性引物的篩選。

1.2.3遺傳多樣性參數(shù)的估算15個白樺種源，每個種源按包含4，8，12和20個個體為研究對象，利用篩選出的17對引物對其擴增后分析各項的遺傳參數(shù)。電泳圖譜中的每條帶均代表了引物與模板DNA互補的一對結(jié)合位點，可記為1個分子標(biāo)記。根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)對照反應(yīng)產(chǎn)物在膠上的對應(yīng)位置，估計擴增產(chǎn)物的分子量大小，有帶的記為 “1”，無帶的記為 “0”。所得結(jié)果為一二元數(shù)據(jù)矩陣，利用Popgene 32軟件計算各項遺傳參數(shù)。利用NTsys 2.10e軟件分析各源間聚類關(guān)系，利用Mintable 15軟件分析群體多態(tài)位點百分?jǐn)?shù)與群體內(nèi)個體數(shù)量之間的關(guān)系和作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1基因組DNA的質(zhì)量檢測及多態(tài)性SRAP引物篩選

使用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取的白樺基因組DNA在質(zhì)量濃度為10.0 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳成像后如圖1所示。樣品DNA為1條清晰明亮的條帶，無明顯拖尾、彌散或其他異?，F(xiàn)象。隨機抽取部分樣品經(jīng)紫外分光光度計檢測，D（260）/D（280）值約1.8。因此可以認為提取的DNA純度較高，符合SRAP-PCR擴增要求［18］。

前期基于表型研究的白樺種源實驗結(jié)果表明：莫爾道嘎和桓仁親緣關(guān)系最近，因此，本研究中，從這2個種源內(nèi)各隨機選擇5個個體用于引物的篩選。以條帶清晰并且群體與個體間有差異條帶的引物為選擇標(biāo)準(zhǔn)，從合成的30對引物中進行篩選。圖2中5個泳道為1組擴增結(jié)果，從左開始分別為莫爾道嘎和桓仁的種源及個體，圖2為引物me2em3組合擴增結(jié)果。從圖2可看出：該引物擴增時，不僅2個種源間存在差異性條帶，且同一種源內(nèi)不同個體間也有清晰差異條帶。這表明引物me2em3符合引物選擇的標(biāo)準(zhǔn)，可用于白樺群體遺傳多樣性的研究。按此標(biāo)準(zhǔn)，從合成的30對引物中，篩選出17個條帶清晰、多態(tài)性高的引物用于實驗分析（表1）。

圖1　部分白樺樣本基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Figure 1　Detection of Betula platyphlla genomic DNA using agarose gel electrophoresis

圖2　白樺SRAP引物（me2em3）的篩選Figure 2　Primer selected for SRPA of B.platyphlla

表1　SRAP引物序列Table 1　primer sequences of SRAP

2.2白樺種源不同樣本數(shù)量估算的群體遺傳多樣性

表2　不同樣本數(shù)量估算的遺傳參數(shù)比較Table 2　Comparison of different sample size estimation for genetic parameters

利用17對SRAP引物分別對包含4，8，12和20個樣本個體的白樺共15個種源進行擴增后分析，并利用POP gene軟件計算各遺傳參數(shù)。表2為不同樣本數(shù)量時白樺群體遺傳多樣性各參數(shù)的平均值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：樣本數(shù)量不同時，各項遺傳參數(shù)平均數(shù)也存在一定差異。這說明樣本數(shù)量對白樺群體的遺傳參數(shù)估算有一定的影響。如當(dāng)群體樣本數(shù)量分別為4，8，12，16和20時，各群體的多態(tài)位點分別為129，132，133，133和134個，多態(tài)位點百分率為95.56%～99.26%。平均等位基因數(shù)為1.955 6～1.985 2，有效等位基因數(shù)為1.420 7～1.427 0，Nei's指數(shù)的變動范圍為0.256 9～0.259 3，Shannon指數(shù)的變動范圍為0.400 8～0.404 1。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在不同樣本數(shù)量條件下，各項遺傳參數(shù)變異最大種源均為涼水，如當(dāng)群體樣本數(shù)量為 4時，共檢測到 135個位點，其中多態(tài)位點有 129個，多態(tài)位點百分率達95.56%。多態(tài)位點百分率為 17.78%～52.33%，平均等位基因數(shù)為1.177 8～1.533 3，有效等位基因數(shù)為1.112 6～1.356 6，Nei's指數(shù)的變動范圍為0.066 0～0.205 9，Shannon指數(shù)的變動范圍為0.098 3～0.304 2，上述的遺傳參數(shù)均表現(xiàn)為涼水種源各項遺傳參數(shù)最大，且在15個種源間變化趨勢一致。當(dāng)群體樣本數(shù)為8，12，16，20時涼水種源各項遺傳參數(shù)均最大。而各項遺傳參數(shù)最小的種源隨樣本數(shù)量的變異均不同，如樣本數(shù)量為12時，共檢測到135個位點，其中多態(tài)位點有133個，多態(tài)位點百分率達98.52%，多態(tài)位點百分率為34.07%～77.78%，平均等位基因數(shù)為1.340 7～1.777 8，有效等位基因數(shù)為1.166 7～1.420 9，Nei's指數(shù)為0.101 5～0.249 2，Shannon指數(shù)為0.156 6～0.378 5。上述遺傳參數(shù)中，汪清種源各項遺傳參數(shù)最小；而樣本數(shù)量為16時，共檢測到135個位點，其中多態(tài)位點有 133個，多態(tài)位點百分率達98.52%，種源的多態(tài)位點數(shù)為47～108，多態(tài)位點百分率為34.81%～80.00%，平均等位基因數(shù)為1.348 1～1.800 0，有效等位基因數(shù)為1.180 0～1.425 4，Nei's指數(shù)為0.108 1～0.251 1，Shannon指數(shù)為0.165 0～0.381 2，上述遺傳參數(shù)中，清源種源的各項遺傳參數(shù)最??；樣本數(shù)量為8和4時，各項遺傳參數(shù)最小的為淖爾種源。此外，4個樣本數(shù)量與其他樣本數(shù)量之間的平均等位基因數(shù)，多態(tài)位點數(shù)，多態(tài)位點百分率，Ht，Hs，Gst和Nm差異較大。

表2同時也表明：樣本數(shù)量對白樺群體內(nèi)與群體間遺傳變異大小的研究結(jié)果也有影響。如當(dāng)群體樣本數(shù)量為4時，47.78%的遺傳變異存在于種源內(nèi)，52.22%的遺傳變異存在于種源間。當(dāng)群體內(nèi)樣本數(shù)量超過8時，研究反映出白樺種群內(nèi)遺傳變異幅度超過群體間；如群體樣本數(shù)量為8時，58.82%的遺傳變異存在于種源內(nèi)，41.18%的遺傳變異存在于種源間；當(dāng)群體樣本數(shù)量為20時，65.88%的遺傳變異存在于種源內(nèi)，34.12%存在于種源間。

2.3不同樣本數(shù)量對群體間親緣關(guān)系分析結(jié)果的影響

為了進一步分析種源內(nèi)樣本數(shù)量差異對于白樺遺傳結(jié)構(gòu)研究結(jié)果的影響，筆者又研究了不同樣本數(shù)量下的白樺種源遺傳進化關(guān)系。圖3表明：樣本數(shù)量對于白樺種源遺傳進化關(guān)系分析結(jié)果有一定的影響。如種源樣本數(shù)量超過12時，15個種源的聚類結(jié)果基本一致（圖3 C，圖3D和圖3E），均可在遺傳距離為0.17時，分成4個類群，而且每個類群包括的種源基本一致。樣本數(shù)量為8時，在0.17的遺傳距離處，15個種源則劃分為5個類群，其中涼水種源單獨聚成一類（圖3B）。而種源樣本數(shù)量為4時，在0.17的遺傳距離處，15個種源被劃分成7個類群，反映不出群體進化的基本規(guī)律（圖3A）。此時，只有當(dāng)遺傳距離達到0.25左右時，15個種源才可劃分成4類，但涼水種源單獨聚成一類，帽兒山、東方紅和烏伊嶺種源聚成一類，新疆和露水河種源聚成一類，其余9個種源聚成一類。由此可見：當(dāng)樣本數(shù)量僅有4個時，其揭示的白樺群體間的親緣關(guān)系與樣本數(shù)量為8個和超過12時存在差異。而且，種源樣本數(shù)量為4時，15個種源遺傳距離變化范圍為0.050 6～0.280 0，其中清源和寧夏種源的遺傳距離最小，桓仁和烏伊嶺種源的遺傳距離最大。當(dāng)種源樣本數(shù)量為分別8，12，16和20，15個種源間在0.044 0～0.212 5范圍內(nèi)變化，而此時淖爾和涼水種源間的遺傳距離最大，莫爾道嘎和桓仁種源的遺傳距離最小。

2.4樣本數(shù)量和主要遺傳參數(shù)的相關(guān)分析

由于樣本數(shù)量對白樺遺傳參數(shù)與遺傳結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果均產(chǎn)生一定的影響，因此為弄清樣本數(shù)量與各遺傳參數(shù)之間的具體關(guān)系，分析了不同樣本數(shù)量與其對應(yīng)的各項遺傳參數(shù)作相關(guān)性。結(jié)果（表3）表明：種源內(nèi)不同樣本數(shù)量與白樺群體多態(tài)位點百分率、群體內(nèi)遺傳變異和群體間遺傳變異參數(shù)相關(guān)性顯著，與總位點數(shù)、多態(tài)位點數(shù)和基因流的相關(guān)性不顯著。這進一步表明，在研究異交群體遺傳多樣性時，應(yīng)科學(xué)估算出群體樣本的最佳數(shù)量。

2.5白樺遺傳多樣性研究時樣本數(shù)量的確定

表3　樣本容量與主要遺傳參數(shù)的相關(guān)性Table 3　Correlation between sample size and main genetic parameters

白樺種源樣本數(shù)量與一些遺傳參數(shù)之間存在顯著或極顯著相關(guān)性，這為確定白樺遺傳多樣性研究時，確定合理的樣本數(shù)量提供了可能。在群體遺傳多樣性研究中，多態(tài)位點百分率越高越有利于分析和研究群體遺傳多樣和遺傳結(jié)構(gòu)，因此對白樺種源不同樣本數(shù)量與多態(tài)位點百分率進行擬合分析（圖4），在95%的置信區(qū)間內(nèi)，兩者之間呈一元二次曲線關(guān)系，決定系數(shù)為89%，表明兩者之間存在較好的相關(guān)性。我們在白樺遺傳多樣性研究時，在綜合考慮成本、技術(shù)難度等基礎(chǔ)上，根據(jù)所需多態(tài)位點百分率大小，計算出所需樣本的數(shù)量。如當(dāng)白樺遺傳多樣性研究時，以最低所需多態(tài)位點百分率98.5%為標(biāo)準(zhǔn)，則每個種源所需樣本數(shù)量為10.673個，實際操作中可設(shè)為11個樣本個體。

圖3　不同樣本數(shù)量時15個白樺種源聚類圖Figure 3　Different number of samples for 15 birch provenance clustering map

3　討論與結(jié)論

對于異交植物，種群內(nèi)和種群間遺傳變異較大，必須有一定數(shù)量個體才能代表該種群的基因庫，因此群體樣本數(shù)量會對研究結(jié)果產(chǎn)生影響。如HENSEN等［19］在研究白鮮Dictamnus albus時發(fā)現(xiàn)，其遺傳多樣性及多態(tài)位點隨群體樣本容量的不同而發(fā)生變化，而且群體大小、多態(tài)位點百分率和遺傳多樣性間存在顯著的相關(guān)性。本研究表明：白樺種源內(nèi)樣本數(shù)量對白樺群體多態(tài)位點百分率、群體內(nèi)遺傳變異和群體間遺傳參數(shù)影響顯著，對總位點數(shù)、多態(tài)位點數(shù)和基因流影響不顯著。ZHAO等［20］研究發(fā)現(xiàn)不同樣本容量的野生大豆Glycine soja種群間得到的遺傳多樣性指數(shù)存在較大差異。本研究同樣發(fā)現(xiàn)：白樺種源樣本數(shù)量不同時，其估算的遺傳多樣性指數(shù)也存在一定差異。如樣本數(shù)量為4時，多態(tài)位點數(shù)和百分率最大與最小的種源分別為涼水和淖爾，而樣本數(shù)量超過8個時，則為涼水和清源。此外，種源內(nèi)不同個體數(shù)量反映的種源內(nèi)與種源間的遺傳變異不同，如種源內(nèi)樣本數(shù)為4時，白樺種源間的遺傳變異大于種源內(nèi)。而當(dāng)群體樣本數(shù)量超過8時，白樺種源內(nèi)的遺傳變異幅度大于種源間。

本研究發(fā)現(xiàn)：群體樣本數(shù)量對遺傳群體間遺傳距離的分析結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，如源樣本數(shù)量為4時，清源和寧夏種源的遺傳距離最小，桓仁和烏伊嶺種源的遺傳距離最大。而樣本數(shù)量超過8時，淖爾和涼水的遺傳距離最大，莫爾道嘎和桓仁的遺傳距離最小。這與樣本數(shù)量超過10時，通過表型分析得到的研究結(jié)果相同，如高玉池等［21］利用表型性狀對帽兒山地區(qū)10年生白樺種源間的親緣關(guān)系進行了分析，結(jié)果表明淖爾和涼水的遺傳距離最大，莫爾道嘎和桓仁的遺傳距離相對較小。此外，樣本數(shù)量也對白樺種源間的遺傳進化關(guān)系分析結(jié)果有一定的影響，如在相同的遺傳距離處（0.17），樣本數(shù)量為4時，15個種源被劃分成7個類群；樣本數(shù)量為8時，15個種源被劃分成5個類群；樣本數(shù)量超過12時，15個種源被劃分成4個類群。上述分析表明：群體樣本數(shù)量不僅對白樺各群體的遺傳參數(shù)產(chǎn)生影響，也對群體間遺傳進化關(guān)系的分析結(jié)果有一定的影響。

圖4　白樺種源樣本數(shù)量與多態(tài)位點百分率的關(guān)系Figure 4　Relationship between Betula platyphylla provenances samples and the percentage of polymorphic loci

異交植物多少個體才能代表一個群體，才能得到較為客觀真實的遺傳多樣性參數(shù)在草本植物或花卉植物中有所研究。如SINGH等［22］在研究野生二粒小麥Triticum dicoccoides的遺傳多樣性時發(fā)現(xiàn)，有的群體5～6個個體就可以使多樣性標(biāo)準(zhǔn)差不大于10%，個別一些則需12個以上的個體。JULIO等［23］發(fā)現(xiàn)，薔薇Rosaceae種群個體數(shù)超過10個以后，就不能提供更多的種群雜合度信息。本研究發(fā)現(xiàn)：白樺種源內(nèi)樣本的數(shù)量與其多態(tài)位點百分率呈一元二次曲線相關(guān)，且決定系數(shù)達89%。并以此為公式計算白樺遺傳多樣性研究時，如設(shè)定要探測到的多態(tài)位點百分率達98.5%以上時，每個種源至少必須含有11個樣本個體。

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Genetic parameters of Betula platyphylla provenances due to sample size

BI Zhihong，WEI Minjing，LIU Yingying，YANG Chuanping，WEI Zhigang
（State Key Laboratory of Forest Genetics and Breeding，Northeast Forestry University，Harbin 150040，Heilongjiang，China）

Population genetic parameters，one of the main constituents of population genetics，and the size of estimated values are influenced by the number of population samples.In this study Betula platyphylla （birch）from Cap Mountain Experimental Forest Farm's Provenance Testing Forest was chosen as the experimental object and sequence related amplified polymorphism（SRAP）technology was used for analysis.Results showed that genetic parameters with different sample sizes had different effects on birch.Genetic variation，population of birch groups，and the percentage of polymorphic numbers within populations influenced genetic parameters.Influence from genetic variation and genetic parameters between groups was strong，but total numbers，polymorphic numbers，and gene flow were not affected.When the sample size was greater than eight，genetic variation amplitude of the birch source was greater than that of the provenances；when the sample size was four，genetic variation was greater than the source of genetic variation among provenances for different samples.For genetic relationships of different provenances with sample size greater than eight，15 kinds of source clustering results were basically the same.However，with a sample size of four，clustering results did not reflect the evolutionary relationship between birch groups.Also，11 birch samples were found to have a polymorphic number that was 98.5%.［Ch，4 fig.3 tab.23 ref.］

forest tree breeding；Betula platyphylla；genetic diversity；sample capacity

S722.3

A

2095-0756（2016）04-0564-07

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.04.003

2015-06-10；

2015-10-09

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（“863”計劃）項目（2011AA100202）

畢志宏，從事木材次生生長等研究。E-mail：bizhihong9191@163.com。通信作者：魏志剛，教授，博士，從事林木遺傳育種等研究。E-mail：zhigangwei1973@163.com