吳旖，趙斌，江仁望

(1.中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 中山 528436；2.國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心 中山健康產(chǎn)品分中心，廣東 中山 528436；3.暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

·中藥工業(yè)·

百部總生物堿緩釋片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

吳旖1,2*，趙斌1,2*，江仁望3

(1.中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 中山 528436；2.國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心 中山健康產(chǎn)品分中心，廣東 中山 528436；3.暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

目的：建立百部總生物堿緩釋片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對(duì)百部總生物堿緩釋片中對(duì)葉百部堿進(jìn)行定性鑒別，采用固相萃取-高效液相-蒸發(fā)光檢測(cè)法建立百部總生物堿緩釋片中對(duì)葉百部堿的含量測(cè)定方法，并測(cè)定其體外釋放度。采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，色譜柱為Agilent Zorbax Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.12%三乙胺溶液(40∶60)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為30 μL；ELSD參數(shù)為漂移管溫度97 ℃、空氣流速為3 mL·min-1。結(jié)果：本品定性鑒別薄層色譜特征明顯，專屬性強(qiáng)。對(duì)葉百部堿的質(zhì)量濃度為0.02～0.30 mg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.86%，百部總生物堿緩釋片在2、8、12 h的累積釋放度分別為10%～30%、50%～70%、80%～100%，均符合規(guī)定。結(jié)論：該分析方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、具有代表性，可作為百部總生物堿緩釋片的質(zhì)量控制方法。

百部；總生物堿；緩釋片；高效液相色譜法；體外釋放度

百部是一味具有鎮(zhèn)咳活性的傳統(tǒng)中藥，始載于公元500年左右陶景洪編纂的《名醫(yī)別錄》?，F(xiàn)在，百部仍然是鎮(zhèn)咳復(fù)方中的常用中藥。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部收載[1]，百部為百部科植物直立百部Stemonasessilifolia(Miq)Miq.、蔓生百部Stemonajaponica(BL.)Miq.或?qū)θ~百部StemonatuberosaLour.的干燥塊根。前期研究發(fā)現(xiàn)，百部生物堿是百部主要的鎮(zhèn)咳活性成分[2]，鎮(zhèn)咳有效部位BB-1(為總生物堿且不含金大剛堿等小毒成分)具有顯著的鎮(zhèn)咳活性[3]，與傳統(tǒng)鎮(zhèn)咳藥相比，其可針對(duì)咳嗽的多種原因進(jìn)行鎮(zhèn)咳，具有高效、低毒的優(yōu)勢(shì)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)百部總生物堿藥物制劑的研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究在百部總生物堿緩釋片工藝研究的基礎(chǔ)上，采用SPE-HPLC-ELSD法[4]建立百部總生物堿緩釋片中對(duì)葉百部堿的含量測(cè)定方法，并對(duì)其體外釋放度[5]進(jìn)行研究，為建立百部總生物堿緩釋片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制制劑質(zhì)量提供參考[6]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)奧泰公司)；DK-S22電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；ZRS-8G智能溶出儀(天大天發(fā)科技有限公司)；SB-5200DT超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；BP61型電子天平(德國(guó)Satorius)；UPT-I-10T超純水器(成都超純科技有限公司)；恒溫水浴鍋(金壇市鴻科儀器廠)。

1.2 材料

百部總生物堿提取物由本課題組提取分離獲得；對(duì)葉百部堿對(duì)照品由本課題組從對(duì)葉百部中提取分離獲得；百部總生物堿緩釋片(自制，批號(hào)分別為20141001，20141002，20141003)；乙腈為色譜純(上海純晶實(shí)業(yè)有限公司)；3 mL×500 mg固相萃取柱(美國(guó)色譜科技公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 對(duì)葉百部堿薄層色譜鑒別

精密稱取對(duì)葉百部堿對(duì)照品適量，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成對(duì)照品溶液。取10粒百部總生物堿緩釋片，快速研勻后，精密稱定1.0 g，加入50 mL 50%甲醇，超聲溶解，過(guò)濾，濾餅用5 mL 50%甲醇洗滌，合并濾液和洗液，并轉(zhuǎn)移至已處理好的C18固相萃取小柱中，先用5 mL水洗脫，再用5 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，精密量取甲醇溶液1.0 mL至25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得供試品溶液。

依照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB薄層色譜法試驗(yàn)，分別吸取2.1中對(duì)照品溶液和供試液各2 μL，在同一硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(16∶4∶1)為展開劑，取出，吹干，再均勻噴上0.5%茚三酮溶液，150 ℃加熱2 min，至斑點(diǎn)顯色明顯后，再置碘蒸氣中熏至斑點(diǎn)清晰。見(jiàn)圖1。在薄層板對(duì)葉百部堿斑點(diǎn)的相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)(為保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，供試品平行點(diǎn)樣3次)。

注：1～3.供試品；4.對(duì)照品。圖1 百部總生物堿緩釋片的TLC圖譜

2.2 百部總生物堿緩釋片的含量測(cè)定

本文根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)，百部總生物堿中對(duì)葉百部生物堿含量高且穩(wěn)定，可以作為百部總生物堿的一個(gè)代表性含量檢測(cè)指標(biāo)，所以在接下來(lái)百部總生物堿緩釋片含量及釋放度測(cè)定中均以對(duì)葉百部堿為代表物進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.1 液相色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.12%三乙胺溶液(40∶60)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：30 μL；ELSD參數(shù)：漂移管溫度為97 ℃；空氣流速為3 mL·min-1。

2.2.2 對(duì)照品及供試液的制備 對(duì)照品溶液的制備精密稱取對(duì)葉百部堿對(duì)照品適量，置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

供試品溶液的制備：取10粒百部總生物堿緩釋片，快速研勻后，精密稱定1.0 g，加入50 mL 50%甲醇，超聲溶解，過(guò)濾，濾餅用5 mL 50%甲醇洗滌，合并濾液和洗液并轉(zhuǎn)移至已處理好的C18固相萃取小柱中，先用5 mL水洗脫，再用5 mL甲醇洗脫。收集甲醇洗脫液，轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶，甲醇定容至刻度，精密量取甲醇溶液1.0 mL，至25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，過(guò)0.22 μm的微孔濾膜即得供試品溶液。

陰性樣品溶液的制備：按百部總生物堿緩釋片的處方工藝，精密稱取各輔料適量，按供試品溶液制備的方法制成陰性樣品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察 專屬性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品、供試品及陰性樣品溶液各10 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，樣品中的輔料成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

注：A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性樣品。圖2 百部總生物堿緩釋片的對(duì)照品、供試品、陰性樣品高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密稱取對(duì)葉百部堿對(duì)照品適量，配置成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，分別精密移取0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，各精密吸取上述溶液及2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液40 μL，注入液相色譜儀中，測(cè)定，記錄峰面積。對(duì)掃描積分值與進(jìn)樣濃度進(jìn)行雙對(duì)數(shù)直線回歸處理，即以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)與峰面積積分值的對(duì)數(shù)作線性關(guān)系，得回歸方程：Y=1.380 2X+5.799 9(r=0.999 7)?？梢?jiàn)，進(jìn)樣濃度在0.02～0.30 mg·mL-1與積分值呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)葉百部堿對(duì)照品溶液(0.2 mg·mL-1)30 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得5次峰面積積分值，峰面積積分值平均值為39 379 682，RSD=1.40%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液(批號(hào)：20141001)30 μL，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積積分值，峰面積積分值平均值為38 958 241，RSD=1.20%，表明供試樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣百部總生物堿緩釋片(批號(hào)：20141001)6份測(cè)定，結(jié)果RSD=1.08%，表明該方法的重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取百部總生物堿緩釋片(批號(hào)：20141001)粉末6份，約0.5 g，精密稱定，分別加入對(duì)葉百部堿60 mg，按供試品制備方法制備得供試品溶液，測(cè)定計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率結(jié)果(n=6)

含量測(cè)定：依2.2項(xiàng)下測(cè)定方法，對(duì)3批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 對(duì)葉百部堿含量測(cè)定結(jié)果

2.3 體外釋放度測(cè)定方法與結(jié)果

取百部總生物堿緩釋片6片，按《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版(一部)釋放度測(cè)定法，附錄第一法(轉(zhuǎn)籃法)操作，1.0%十二烷基硫酸鈉溶液(SDS)800 mL作為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，溫度為(37±0.5)℃，分別于2、4、6、8、10、12 h取樣5 mL，30 s內(nèi)用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，同時(shí)補(bǔ)充等體積的同溫介質(zhì)。精密移取續(xù)濾液4 mL于10 mL具塞試管中，揮干溶劑，加入60%乙醇適量，溶解后搖勻，定容至10 mL。照2.2項(xiàng)下測(cè)定方法測(cè)定對(duì)葉百部生物堿含量，以對(duì)葉百部生物堿為代表物進(jìn)行檢測(cè)，并按下式計(jì)算緩釋片的累積釋放度：

Q=CnVt+Vs∑Cn-1

其中，Q表示緩釋片累積釋放度；Cn表示實(shí)測(cè)濃度；Vt表示溶出介質(zhì)體積；Vs表示取樣體積。

取3批百部總生物堿緩釋片樣品，測(cè)定在各時(shí)間點(diǎn)的體外釋放度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3批樣品的體外釋放度測(cè)定結(jié)果(%)

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》有關(guān)規(guī)定，百部總生物堿緩釋片在2、8、12 h的累積釋放度分別為10%～30%、50%～70%、80%～100%。結(jié)果表明，3批百部總生物堿緩釋片的釋放度驗(yàn)證結(jié)果均較理想，12 h的累積釋藥量均達(dá)95%以上，且重復(fù)性好，方法穩(wěn)定、可行，表明該緩釋片能達(dá)到很好緩釋效果。

3 討論

3.1 體外釋放度測(cè)定方法的選擇

百部總生物堿緩釋片的凝膠骨架材料易吸水膨脹并產(chǎn)生較大粘性，易粘于杯底，故采用轉(zhuǎn)籃法進(jìn)行測(cè)定。

3.2 方法評(píng)價(jià)

百部總生物堿的含量測(cè)定方法已有文獻(xiàn)報(bào)道的有2個(gè)：溴甲酚綠顯色法和雷氏鹽比色法。由于比色法自身的靈敏度低，并且樣品制備過(guò)程中操作復(fù)雜，導(dǎo)致這兩種方法的測(cè)定結(jié)果并不準(zhǔn)確。HPLC-ELSD是近年來(lái)檢測(cè)百部樣品比較理想的分析方法。實(shí)驗(yàn)建立了制劑中對(duì)葉百部堿的薄層色譜鑒別方法，以對(duì)葉百部堿含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用SPE-HPLC-ELSD法建立百部總生物堿緩釋片中對(duì)葉百部堿的含量測(cè)定方法。運(yùn)用此分析方法測(cè)定了3批百部總生物堿緩釋片中對(duì)葉百部堿的含量，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為120.18 mg·g-1。說(shuō)明對(duì)葉百部堿在所測(cè)的3批緩釋片中含量較為穩(wěn)定，可以作為百部緩釋片含量檢測(cè)的一個(gè)代表性指標(biāo)。同時(shí)運(yùn)用此方法測(cè)定了百部總生物堿緩釋片的體外釋放度，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、可靠，專屬性、重復(fù)性好，可用于百部總生物堿緩釋片的質(zhì)量控制。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 彭蜀瑩，沈建華，葉陽(yáng).4種百部生物堿的質(zhì)譜行為研究[J].分析化學(xué)，2006，34：497-502.

[3] 呂麗華，葉文才，趙守訓(xùn)，等.直立百部的化學(xué)成分[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，36(5)：408-410.

[4] Zhang RongRong，Lu DanYi，Yang ZhenYa，et al.Simultaneous quantification of six alkaloid components from commercial Stemonae Radix by SPE-HPLC-ELSD[J].Phramacognosymagazine,2015，11(42)：360-367.

[5] Zhang RongRong，Tian HaiYan，Wu Yi,et al.Isolation and chemotaxonomic significance of stenine-and stemoninine-type alkaloids from the roots of Stemona tuberosa[J].ChineseChemicalLetters,2014，38(9)，1252-1255.

[6] 張亞中，薛玉梅，陶建生.百部生物堿的研究現(xiàn)狀和思考[J].中成藥，2008，30(2)：248-251.

StudyonQualityStandardofStemonaAlkaloidsSustained-releaseTablets

WUYi1,2*，ZHAOBin1,2*，JIANGRenwang3

(1.ZhongshanTorchPolytechnic，Zhongshan528436，China；2.Zhongshanhealthproductscenter，NationalEngineeringResearchCenterformodernizationoftraditionalChineseMedicine，Zhongshan528436，China；3.CollegeofPharmacyJinanUniversity，Guangzhou510632，China)

Objective：To establish the quality control standard for the total alkaloids sustained-release tablets.Methods：The total alkaloids in the Radix Stemonae sustained release tablets were identified by TLC，and the content of the total alkaloids was determined by SPE-HPLC-ELSD method，and also the release rate of the Stemona alkaloids was determined.The method parameters were as follows：Evaporative light-scattering detector；Chromatographic column：Agilent Zorbax Extend-C18(250×4.6 mm，5 μL)；Mobile phase：acetonitrile-0.12% triethylamine solution(40∶60)；Flow rate：1.0 mL·min-1；Column temperature 25 ℃；Sample quantity：30(including l；ELSD parameters：the drift tube temperature is 97 ℃；The air flow rate for 3 mL·min-1.Results：This product characterized obviously in TLC，and the specificity was strong.Tubero stemonine concentration with peak area over the 0.02-0.30 mg·mL-1range showed a good linear relationship.The average recovery rate was 99.86%，the accumulative release rate of total alkaloids sustained-release tablets were 10%-30%，50%-70%，80%-100%，respectively，at 2，8，12 h，which conformed to the stipulation.Conclusion：The analysis method is simple，fast，accurate and representative，which can be used as the quality control method of the total alkaloids sustained-release tablets.

Radix Stemonae；total alkaloids；sustained-release tablets；HPLC；invitrorelease

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.023

2015-11-25)

廣東省新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)(2013A022100029)；中山市社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目(2013A3FC0325)

*

吳旖，副主任藥師，研究方向：藥物制劑的研究與開發(fā)；Tel：(0760)88291713，E-mail:52419050@qq.com