李新宇　董詩浩　譚　墾

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所，昆明650201）

中華蜜蜂報(bào)警信息素的生物活性檢測(cè)

李新宇董詩浩譚墾

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所，昆明650201）

蜜蜂是一種典型的社會(huì)性昆蟲，生活在黑暗的蜂巢中，個(gè)體之間的信息交流主要是通過信息素。在蜜蜂蜂群中，信息素可以在蜂群的防衛(wèi)行為中發(fā)揮重要作用。當(dāng)蜜蜂受到侵害或驚擾時(shí)便進(jìn)行反擊，蜜蜂會(huì)從上顎腺和蜇針腺體產(chǎn)生報(bào)警信息素，能引起同巢守衛(wèi)蜂的蜇刺反應(yīng)和自衛(wèi)行動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)中華蜜蜂的報(bào)警信息素成分進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)利用實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中華蜜蜂報(bào)警信息素的生物活性。結(jié)果表明，報(bào)警信息素能在很大程度上誘導(dǎo)蜜蜂的防衛(wèi)行為。

中華蜜蜂；報(bào)警信息素；防衛(wèi)行為；生物測(cè)定

1　引言

報(bào)警信息素是蜂群中遇到外界干擾或危險(xiǎn)時(shí)蜜蜂個(gè)體所釋放的提醒或招募其他蜜蜂個(gè)體驅(qū)避或攻擊等防御行為的一種信息素。

當(dāng)蜜蜂受到侵害或驚擾時(shí)便奮起進(jìn)行反擊。當(dāng)工蜂在蜇刺時(shí)，從蜇針腺分泌一種警告信息素標(biāo)記在“敵體”上，當(dāng)作其他蜜蜂攻擊的靶子。1966年Boch等首次從西蜂工蜂蜇針腺分泌物中鑒定出報(bào)警信息素的一個(gè)主要成分為乙酸異戊酯［1］，它有類似香蕉的氣味。一般說來剛出房的工蜂蜇針內(nèi)沒有乙酸異戊酯，但它們的日齡達(dá)到15～20日齡時(shí)，乙酸異戊酯的含量可以達(dá)到1～3μg/只。后來，又有20余種成分被陸續(xù)鑒定出來［2］，如乙酸正丁酯，乙酸正已酯，乙酸正辛酯等。

工蜂報(bào)警信息素功能是在外來的侵襲者襲擊時(shí)，工蜂用蜇針刺向來犯者，并把蜇針留在侵襲者體內(nèi)，蜇針內(nèi)釋放的報(bào)警激素在空氣中很快傳播，從而標(biāo)明了侵襲者的方位。同時(shí)，從蜇針基膜釋放出報(bào)警信息素吸引其他守衛(wèi)蜂產(chǎn)生攻擊行為［3］。由于這些物質(zhì)揮發(fā)得快，一旦侵犯終止，“警報(bào)”也隨之解除，蜂群便又恢復(fù)了平靜。

工蜂的上顎腺能分泌另外一種報(bào)警信息素。當(dāng)工蜂向來犯者蜇刺攻擊時(shí)，常常用上顎咬住對(duì)方，將一些化學(xué)物質(zhì)涂在那里，以引導(dǎo)其他蜜蜂前去進(jìn)攻。據(jù)Shearer和Boch鑒定這種報(bào)警信息素的主要成分為庚酮-2［4］。

工蜂的蜇針腺是蜜蜂報(bào)警信息素的主要來源。乙酸異戊酯的報(bào)警強(qiáng)度是2-庚酮的20～70倍［5］。報(bào)警信息素的某些成分帶有強(qiáng)烈的薰衣草和茉莉氣味，增強(qiáng)警戒蜂產(chǎn)生的氣味信號(hào)，另外揮發(fā)物中的其他成分還對(duì)守衛(wèi)蜂的反應(yīng)頻率、速度、持續(xù)時(shí)間、強(qiáng)度產(chǎn)生作用。

除了意大利蜜蜂，其他品種的蜜蜂，如中華蜜蜂、小蜜蜂，大蜜蜂等也都能通過釋放報(bào)警信息素動(dòng)員起來進(jìn)行自衛(wèi)。像菲律賓的大蜜蜂，經(jīng)常會(huì)傾巢而出，猛烈地向來犯者進(jìn)攻［6］。本研究就中華蜜蜂報(bào)警信息素主要成分進(jìn)行測(cè)定，并就這些的生物活性進(jìn)行檢測(cè)，從而探討蜜蜂的防御生物學(xué)。

2　材料與方法

實(shí)驗(yàn)在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所的實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)進(jìn)行。其他實(shí)驗(yàn)材料還包括東方蜜蜂（Apis cerana）、昆蟲針、蠟盤、計(jì)時(shí)器、計(jì)數(shù)器、濾紙、鑷子、冰箱、自制蜜蜂采集瓶、試管、樣品收集瓶、固相微萃取針。主要試劑有甲醇、正己烷等。使用的儀器主要有Agilent 7890B型氣相色譜儀，質(zhì)譜儀等。

蜜蜂樣本采集于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所蜂場(chǎng)內(nèi)，從中隨機(jī)選取幾群群勢(shì)較強(qiáng)蜂群的出巢采集蜂。

2.1中華蜜蜂報(bào)警信息素主要成分的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用氣質(zhì)聯(lián)譜法來測(cè)定中華蜜蜂報(bào)警信息素的主要成分。首先將采集回的蜜蜂轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室中，在冰箱中冰凍麻醉，之后取出蜜蜂用鑷子把蜜蜂毒囊取出。每次取3～5只蜜蜂的毒囊，將取出的毒囊放入樣品瓶中。由于蜜蜂報(bào)警信息素的主要成分易揮發(fā)，所以我們把固相萃取針針頭從玻璃小瓶瓶蓋上的橡膠模上插入，打開固相萃取針萃取30 min。萃取結(jié)束后，取出萃取針，在氣相色譜上進(jìn)樣檢測(cè)。再通過質(zhì)譜儀檢測(cè)出中蜂報(bào)警信息素的具體主要成分和含量。或者采用有機(jī)溶劑萃取法，每次取3～5只蜜蜂的毒囊，將取出的毒囊放入樣品瓶中。向樣品瓶中加入1 ml正己烷，沒過樣品毒囊。之后用針刺破毒囊，萃取30 min。取出萃取液，進(jìn)行檢測(cè)。

2.2中華蜜蜂報(bào)警信息素的生物活性檢測(cè)

我們選取幾群群勢(shì)較強(qiáng)的蜂群，使用自制的蜜蜂采集瓶從巢門口抓取出巢的蜜蜂，之后放入冰箱冷凍麻醉。用昆蟲針插如蜜蜂胸部固定在蠟盤上。用小鑷子把蜜蜂毒囊拔出，每次取3只蜜蜂的毒囊放在濾紙上；將濾紙放在離巢門口不遠(yuǎn)處，之后統(tǒng)計(jì)0～3min，3～6 min，6～9 min三個(gè)時(shí)間段內(nèi)蜜蜂飛到濾紙上的只數(shù)。同時(shí)取一張無任何物質(zhì)的濾紙放在巢門口作為對(duì)照組；同樣記錄3個(gè)時(shí)間段內(nèi)蜜蜂飛上濾紙的個(gè)數(shù)。每群蜜蜂實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每天進(jìn)行1次，且在基本一致的天氣情況以及時(shí)間下進(jìn)行。

3　結(jié)果與分析

3.1中華蜜蜂報(bào)警信息素成分的檢測(cè)結(jié)果

圖1　中華蜜蜂報(bào)警信息素成分檢測(cè)的色譜圖

通過GC-MS分析從蜜蜂毒囊提取的報(bào)警信息素成分發(fā)現(xiàn)，其主要成分是乙酸異戊酯和乙酸芐酯，還包括乙酸正丁酯，乙酸正已酯，乙酸正辛酯，乙酸正癸酯，乙酸苯酯，乙酸二十酯，辛酸，苯甲酸，苯酚，對(duì)甲酚，正丁醇，正戊醇，異戊醇，正辛醇，十八醇，二十醇以及順-11-二十碳烯-1-醇等二十余種成分。檢測(cè)出的報(bào)警信息素成分與西方蜜蜂報(bào)警信息素成分基本一致。

3.2中華蜜蜂報(bào)警信息素生物活性檢測(cè)結(jié)果

圖2　蜜蜂攻擊濾紙的情況

通過實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濾紙上有毒囊時(shí)，巢門口的防衛(wèi)蜂以及部分回巢的采集蜂會(huì)有撞擊或者撕咬濾紙的行為，并且附近蜜蜂顯得焦躁不安。實(shí)驗(yàn)組撞擊濾紙的蜜蜂個(gè)數(shù)明顯比對(duì)照組多。根據(jù)重復(fù)測(cè)量方差分析可知實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組P＜0.01，差異顯著。由此可以證明，蜜蜂報(bào)警信息素對(duì)蜜蜂，特別是防衛(wèi)蜂有較明顯的誘導(dǎo)防衛(wèi)行為的作用。

4　討論

我們的研究結(jié)果表明，有毒囊的濾紙比起空白濾紙招致更多的攻擊行為，可以認(rèn)為中華蜜蜂的報(bào)警信息素同西蜂等蜂種的報(bào)警信息素在作用上大體一致，能在很大程度上誘導(dǎo)蜜蜂的防衛(wèi)行為。

守衛(wèi)蜂監(jiān)察蜂群巢門口，監(jiān)測(cè)同群蜜蜂的進(jìn)出與非同群蜜蜂的入侵［7］。Wittmann［8］等發(fā)現(xiàn)守衛(wèi)蜂在遇到危險(xiǎn)的時(shí)候會(huì)利用氣味作為線索來進(jìn)行攻擊。蜜蜂會(huì)揮動(dòng)它們的翅膀，做出攻擊警告的姿勢(shì)，飛向移動(dòng)目標(biāo)，如黑色的物體，甚至進(jìn)行針刺攻擊［9］。我們的實(shí)驗(yàn)觀察到許多蜜蜂會(huì)圍繞有毒囊的濾紙亂飛，但沒有明顯的攻擊行為，我們推測(cè)蜜蜂攻擊時(shí)需要一個(gè)視覺線索，而濾紙可能不是一個(gè)合適的視覺線索，在這一問題上我們還需要進(jìn)一步研究。

［1］Boch Rand Shcarcr D A.Iso-pentyl acetate in stings of honeybees of different ages.Journal of Apicultural Research 1966，5： 65-70.

［2］Free J B.Pheromone ofSocial Bees.Chapman and Hall，NewYork， 1987.134-143.

［3］蘇榮.蜜蜂信息素的研究進(jìn)展 ［J］.福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995（24）2：231-237.

［4］Shearer D A，Boch R.2-heptanone in the mandibular gland secretion ofthe honeybee.Nature，1965，206：530.

［5］Boch R，Shearer D A，Petrasovits A.Efficacies of two alarm substances ofthe honeybee［J］.J.Inse.Physiol.1970，16：17-24.

［6］Morse and Laig.Apis dorsata in the Philippines.Monograph from the Philippine Association of Entomology，1969，1：1-96.

［7］Breed MD.Defensive behavior.See Ref［J］.1991，127：299-308.

［8］Wittmann D，Radtke R，Zeil J，et al.Robber bees（Lestrimelitta limao）and their host chemical and visual cues in nest defense by Trigona（Tetragonisca）angustula（Apidae：Meliponinae）［J］.J. Chem.Ecol，1990，16：631-641.

［9］Bowden RM，Garry MF，Breed MD.Discrimination of con-and heterospecific bees by Trigona（Tetragonisca）angustula guards［J］. J.Kansas Entomol.Soci，1994，67：137-139.

The biological activity test of the Apis cerana alarm pheromones

Li XinyuDong ShihaoTan Ken
（Eastern Bee Research Institute of Yunnan Agricultural university，kunming 650201）

The bee is a kind of typical social insects，life in the darkness of the hive，exchange of information between individuals mainly through the pheromone.In honeybee colonies，pheromones can play an important role in the defense of the swarm behavior.When bees are violated or disturbed，they will fight back，the bees will produce alarm pheromones from the upper jaw gland and venom glands，can recruit nest mates to have sting reaction and self-defense action.This experiment for the bee alarm pheromone components were tested，and at the same time using the experimental detection of the biological activity of the honeybee Apis cerana’s alarm pheromones.Results show that the alarm pheromones can induce defense behavior.

Apis cerana；alarm pheromones；defensive behavior；bioassay

國家自然基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：31260585）

李新宇（1989-），男，山東淄博人，在讀碩士研究生，主要從事蜜蜂生物學(xué)研究。

譚墾，男，教授，博導(dǎo)，主要從事蜜蜂生物學(xué)研究，E-mail：eastbee@sina.com。