鄭火青貢紅日蘇曉玲陳秀賢華啟云趙東緒胡福良

（1浙江大學動物科學學院，杭州310058；2金華市農(nóng)業(yè)科學研究院，金華321000）

浙江金華地區(qū)越冬意蜂群大量死亡原因調(diào)查與分析

鄭火青1貢紅日1蘇曉玲2陳秀賢1華啟云2趙東緒2胡福良1

（1浙江大學動物科學學院，杭州310058；2金華市農(nóng)業(yè)科學研究院，金華321000）

2014年冬，浙江多地意蜂群出現(xiàn)大量死亡。為了探究這一突發(fā)事件的原因，我們實地察看了現(xiàn)場、發(fā)放了調(diào)查問卷，并取樣進行了病毒和微孢子蟲的檢測分析。結果表明，本次突發(fā)事件的主要原因可以排除急性農(nóng)藥中毒和急性污染物中毒的可能性。在病毒感染率上，患病蜂群DWV的感染率顯著高于健康蜂群，但健康蜂群BQCV的感染率卻顯著高于患病蜂群。在病毒多重感染水平和病毒滴度上，患病蜂群顯著高于健康蜂群；同時，患病蜂群N.ceranae的感染率和感染水平都要顯著高于健康蜂群。本研究提示多重病毒感染、DWV和IAPV的高病毒滴度及N.ceranae的感染和這次蜜蜂死亡事件密切相關。鑒于狄斯瓦螨在促進病毒病方面的作用，蜂螨也有可能是蜂群死亡的間接原因之一。此外，本研究同時表明，幾乎所有的表面健康蜂群同時感染多種病原，健康情況堪憂。為避免類似死亡事件的發(fā)生，一方面需力求降低病原體的感染水平，另一方面可以調(diào)整飼養(yǎng)管理方式促進蜜蜂的健康水平，同時減少外界不良因素的刺激。

意蜂；蜂群死亡；病毒；多重感染；微孢子蟲；狄斯瓦螨

1　前言

蜜蜂在維持生物多樣性以及提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力方面發(fā)揮著重要作用［1，2］。然而，近些年國際上報道了大量西方蜜蜂蜂群死亡的現(xiàn)象。盡管目前還沒有確切的答案來解釋這種現(xiàn)象，但是很多因素包括寄生蟲、病原微生物［3］、農(nóng)藥中毒［4］以及氣候參數(shù)［4］被認為是造成蜂群損失的主要原因［5］。

至今為止，已從蜂群中檢測出22種蜜蜂病毒［6-8］，其中蜜蜂急性麻痹病毒（acute bee paralysis virus，簡稱ABPV）、蜜蜂黑蜂王臺病毒（black queen cell virus，簡稱BQCV）、蜜蜂慢性麻痹病毒（chronic bee paralysis virus，簡稱CBPV）、蜜蜂卷翅病毒（deformed wing virus，簡稱DWV）、蜜蜂以色列急性麻痹病毒（israeli acute paralysis virus，簡稱IAPV）、蜜蜂克什米爾病毒（kashmir bee virus，簡稱KBV）以及蜜蜂囊狀幼蟲病毒（sacbrood virus，簡稱SBV）最為常見。一般情況下，這些病毒以隱性感染的形式存在于蜂群中［6］，可是當外界環(huán)境以及飼養(yǎng)條件對蜂群健康產(chǎn)生壓力時，就有可能誘導蜂群出現(xiàn)癥狀并最終致死［9］。另外，西方蜜蜂的微孢子蟲病特別是由N.ceranae引起的孢子蟲病同樣被看作是蜂群損失的主要誘導因素之一［10］。

我國蜜蜂飼養(yǎng)管理精細，一直以來未見有如美國大范圍蜜蜂死亡現(xiàn)象的報道。但是近年來，在浙江及周邊地區(qū)不時有蜂農(nóng)反映蜜蜂死亡嚴重。2014/2015年越冬期間在浙江省金華、慈溪和平湖等地出現(xiàn)大量蜂群死亡現(xiàn)象，有不少蜂場全場覆沒。針對這一問題，我們在金華地區(qū)對蜂群死亡原因開展了調(diào)查，同時取樣分析了病毒和微孢子蟲的感染情況。

2　材料與方法

2.1問卷調(diào)查

向金華地區(qū)34家轉地蜂場發(fā)放調(diào)查問卷。調(diào)查內(nèi)容包括蜂群損失程度、周邊環(huán)境、蜜蜂死亡癥狀、治螨情況等。其中，蜂群損失程度分嚴重（蜂群損失達50%以上）、中等（蜂群損失30～50%左右）、輕微（蜂群損30%以下）和正常四個等級。

2.2樣本收集

2014年12月至2015年1月間，從15個有明顯損失的蜂場收集42群患病群的樣本，同時從10個蜂場收集40群健康群的樣本。每群取約100只蜜蜂。

2.37種常見蜜蜂病毒檢測

取30只蜜蜂加入2 ml水研磨，取170 μl研磨液用于檢測病毒，另取30 μl研磨液用于微孢子蟲種鑒定。分別參照北京艾德萊生物科技有限公司的試劑盒（RN03）以及東洋紡（上海）生物科技有限公司的試劑盒（FSQ-201）步驟說明進行總RNA提取和反轉錄，其中10 μl的反轉錄體系中含有1 μg的RNA。參照GenStar康潤生物科技有限公司的PCR mix試劑盒（A112-10）進行病毒檢測。病毒檢測的引物參照文獻［11，12］。PCR的反應體系為12.5 μl水，1.25 μl 10μM的正向和反向引物，2 μl的模板，12.5 μl的2×Taq PCR StarMix，總體積為25 μl。PCR反應過程：94℃2 min。35個循環(huán)：94℃30 s；54℃30 s；72℃30 s。最后72℃，延伸5 min。

2.4DWV和IAPV的qRT-PCR分析

已有大量報道表明DWV和IAPV與蜂群損失有關，而且我們的樣本中這兩種病毒流行率非常高，因此我們對這兩種病毒進行了絕對定量分析［3，10］。以蜂場為單位，將每個蜂場取到的所有健康樣本或者患病樣本分別視為一個大的混合樣本，每個大混合樣本含有70只蜜蜂。RNA提取以及反轉錄過程同上。DWV和IAPV病毒的標準曲線繪制如下：引用已發(fā)表文獻的引物［12，13］制備重組質粒，用于制備標準曲線。絕對定量qPCR反應中采用SYBR Green法對DWV和IAPV進行定量，反應體系為10 μl THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（QPS-201，Toyobo，Shanghai），1 μl 10 μM的正R向和反向引物，6 μl的水，2 μl的模板，總體積為20 μl。反應程序：95℃ 1min；40個循環(huán)反應：95℃ 15s；60℃1min；溶解曲線分析：95℃15 s；60℃15 s；95℃15 s。60℃至95℃的反應總時間為20 min。取6 μl PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠進行電泳觀察，根據(jù)陽性對照（陽性質粒）看其條帶大小。

2.5微孢子蟲孢子計數(shù)和種的鑒定

從每群蜂樣本中取30只蜜蜂，取腹部加30 ml水研磨，通過鏡檢法檢測孢子數(shù)［14］。將30只蜜蜂加2 ml水研磨得到的30 μl研磨液進行DNA提取。DNA提取參照Favorgen公司試劑盒（FATGK001，Taiwan，China）步驟說明。采用Nosema apis和Nosema ceranae特異性引物進行PCR擴增，取6 μl PCR產(chǎn)物進行2.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)引物擴增結果確定微孢子蟲種類。

2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

采用Shapiro-wilk法測試各組數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用參數(shù)檢驗Student's-test比較，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗Mann-Whitney U test?？ǚ綑z驗用于比較蜂群中微孢子和病毒感染水平的差異。P值小于0.05為差異顯著。

3　結果

3.1調(diào)查結果

3.1.1損失程度：調(diào)查的34家轉地蜂場中，損失嚴重的蜂場達16家（47%），損失中等8家，損失輕微2家，未見異常的有8家。

3.1.2死亡原因：本次調(diào)查的蜂場分布于金華地區(qū)不同區(qū)域，場地都是往年返場后同期的放蜂場地，周邊未見有毒蜜粉源植物開花。損失嚴重的蜂場中有1家明確是農(nóng)藥中毒。所有蜂場都進行規(guī)律地治螨，損失嚴重和損失中等的蜂場中各有1家蜜蜂螨害嚴重，其余所有蜂場蜜蜂在死亡前表現(xiàn)健康，能排除螨害和農(nóng)藥中毒的原因，且在春繁開始后就自然好轉。后續(xù)分析中剔除螨害嚴重和農(nóng)藥中毒的3家蜂場。

損失嚴重的14家蜂場（已除去農(nóng)藥中毒和螨害嚴重的各1家蜂場），10家蜂場明確附近無工業(yè)污染源，4家蜂場附近有不同程度的污染源，另有2家蜂場附近有藥廠，不能排除污染的影響。損失中等的7家蜂場，5家明確附近無工業(yè)污染源，1家受螨害、大肚病和污染源的共同影響；另有2家蜂場附近有藥廠，不能排除污染的影響。損失輕微的蜂場，有1家反映附近有污染源和甘露蜜。

3.1.3死亡癥狀：死亡原因未知的損失嚴重和損失中等的21家蜂場中，有19家蜂場強群死亡更嚴重，有2家蜂場強群和弱群死亡相當。

15家蜂場幼蜂、壯年蜂和老蜂均有死亡，4家主要是幼蜂死亡，1家主要是壯年蜂死亡，1家主要是壯年蜂和老年蜂死亡；所有損失中等以上的蜂場都在箱門口看見大量死蜂，有5家蜂場在箱內(nèi)也能見大量死蜂。

17家蜂場蜜蜂有爬蜂癥狀，16家蜂場死亡蜜蜂有伸吻現(xiàn)象，15家有展翅現(xiàn)象，16家腹部內(nèi)彎，13家蜂場反映蜜蜂死亡前較往常暴躁，僅有4家蜂場有反映死亡蜜蜂有大肚子現(xiàn)象。蜂場損失情況、污染源情況及蜜蜂死亡癥狀統(tǒng)計見表1。

表1　蜂場損失程度、污染源情況和蜜蜂死亡癥狀

3.2蜂群的病毒感染情況

3.2.1感染率比較：檢測結果顯示（圖1），蜜蜂病毒感染很普遍，BQCV、DWV和IAPV三種病毒不管在健康群還是患病群中的感染率都超過了75%，其中BQCV在健康群中的感染率達95%，IAPV在健康群和患病群中的感染率分別達90%和87.4%。CBPV、KBV和SBV檢出率較低，本研究未檢測到ABPV?；疾》淙旱腄WV感染率顯著高于健康蜂群的感染率（P=0.046），而BQCV在健康蜂群的感染率卻顯著高于在患病蜂群中的感染率（P=0.029）。此外，健康蜂群的CBPV、IAPV、KBV以及SBV的感染率與患病蜂群的感染率之間均不存在顯著性差異（P＞0.05）。

3.2.2多重感染比較：所有蜂群都能檢測到病毒，除1群外，所有蜂群都被2種或2種以上蜜蜂病毒感染（表2）。患病蜂群中以感染3種和4種蜜蜂病毒為主，感染率分別是35.1%和47.4%。健康蜂群以感染3種蜜蜂病毒（47.5%）為主，其次是2重感染（25%）和4重感染（22.5%）?；疾》淙汉徒】捣淙涸诟腥?種蜜蜂病毒的比例上不存在顯著差異（P=0.279），但患病蜂群4重感染率顯著高于健康蜂群（P=0.017），2重感染率顯著低于健康蜂群（P=0.01）。

圖1　患病蜂群和健康蜂群6種常見蜜蜂病毒的感染率（“*”表示P＜0.05）

表2　蜂群中蜜蜂病毒多重感染情況

3.2DWV和IAPV病毒滴度

DWV病毒在患病蜂群和健康蜂群中的病毒滴度分別為（1.95±1.58）×108和（8.31±1.39）×106，且二者存在顯著性差異（t=2.202，P=0.038）。患病蜂群的IAPV病毒滴度（（3.72±1.68）×107）也顯著高于健康蜂群的病毒滴度［（1.35±1.57）×106］（U=34，P=0.035）（圖2）。

3.3微孢子蟲的計數(shù)和鑒定

患病蜂群微孢子蟲的檢出率（66.7%）極顯著的高于健康蜂群（17.5%）（P＜0.001）。同時患病蜂群感染微孢子蟲孢子數(shù)平均達到了（2.12±0.72）×106，極顯著地高于健康蜂群的微孢子蟲孢子數(shù)（4.3±0.19）×105（U=435，P＜0.001，圖3）。

微孢子蟲種鑒別結果表明所有蜂群微孢子蟲均為N.ceranae，沒有發(fā)現(xiàn)N.apis。

4　討論

圖2　患病蜂群和健康蜂群DWV和IAPV病毒滴度比較（“*”表示P＜0.05）

圖3　患病蜂群和健康蜂群的微孢子蟲孢子數(shù)比較（“***”表示P＜0.001）

針對國外大量的蜂群死亡現(xiàn)象，研究逐漸指向是病原、農(nóng)藥及環(huán)境等因素共同作用的結果［3，4，10］。近幾年來，已在浙江省連續(xù)出現(xiàn)越冬蜂大量死亡的現(xiàn)象，而且逐年越發(fā)嚴重。通過調(diào)查，我們基本能排除急性農(nóng)藥中毒或環(huán)境污染作為主要因素的可能性。狄斯瓦螨是西方蜜蜂的首要病害，但在這次事件中，蜂農(nóng)都明確蜂螨都得到了有效控制，我們的實地勘察也確認了這一點，可以排除蜂螨作為直接致病因素的可能性；但鑒于蜂螨在促進蜜蜂病毒病爆發(fā)方面的關鍵作用，我們并不能排除蜂螨作為間接致病因素的可能性。

已有多項研究表明，DWV和IAPV與國際上的蜂群損失有密切關系［3，10］。本研究病毒檢測結果表明，患病蜂群DWV和IAPV滴度都要顯著高于健康蜂群，說明DWV和IAPV滴度與蜂群死亡有著密切關系。

本研究中幾乎所有的蜂群都有1種以上的蜜蜂病毒感染?；疾》淙阂酝瑫r感染3種或4種病毒為主，健康蜂群以同時感染3種病毒為主，患病蜂群和健康蜂群相比，多重感染情況更為嚴重。這一結果表明，病毒的多重感染與蜂群死亡有關。

同時，需要指出的是，本研究檢測到了除ABPV之外的6種病毒，且所有蜂群都有病毒感染，尤其是BQCV、DWV和IAPV在健康蜂群或患病蜂群的感染率都在75%以上，此外BQCV在健康蜂群的感染率顯著高于患病蜂群的感染率，說明蜜蜂健康狀態(tài)堪憂。在氣候適宜、生產(chǎn)強度不大和營養(yǎng)充足等條件下，蜂群能夠不表現(xiàn)任何癥狀，一旦環(huán)境條件惡劣、生產(chǎn)強度大或營養(yǎng)缺失等不良因素出現(xiàn)，蜂群可能就會出現(xiàn)衰敗或崩潰。而越冬期間，外界條件惡劣，蜂群營養(yǎng)缺失，是蜂群健康最敏感的時期。

N.ceranae在很多國家被認為是引起蜂群損失的重要原因。本研究中，患病蜂群的檢出率和孢子數(shù)都要顯著高于健康蜂群，說明N.ceranae也與本次蜜蜂死亡事件密切相關。本研究中N.ceranae在健康蜂群中的檢出率偏低，可能與取樣的季節(jié)有關。

總之，本研究表明，多重病毒感染、DWV和IAPV的高病毒滴度及N.ceranae的感染和這次蜜蜂死亡事件密切相關。同時表明，即使是表面健康的蜂群也同時受到多種病原的感染，甚至在病毒感染率上與患病蜂群沒有太大差異。這些病原的感染降低了蜜蜂的健康水平，但還未到出現(xiàn)明顯癥狀的水平，一旦加以外界不良因素的刺激，原本脆弱的健康可能崩潰。

本研究提示，越冬期間蜜蜂突然死亡可能是外界不良因素的刺激和原本潛伏于蜜蜂體內(nèi)的病原共同作用的結果。為避免類似死亡事件的發(fā)生，一方面需降低病原物的感染水平，另一方面可以調(diào)整飼養(yǎng)管理促進蜜蜂的健康水平，同時減少外界不良因素的刺激。

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Investigation and analysis of large scale colony losses of Apis mellifera in winter in Jinhua，Zhejiang

Zheng Huoqing1，Gong Hongri1，Su Xiaoling2，Chen Xiuxian1，Hua Qiyun2，Zhao Dongxu2，Hu Fuliang1
（1 College of Animal Sciences，Zhejiang University，Hangzhou310058；2 Academy of Agricultural Sciences of Jinhua，Jinhua，321000）

Large scale colony losses of Apis mellifera happened in several regions in Zhejiang Province in the winter of 2014.In order to explore the causes of the colony losses，we inspected the occurrence sites，issued the questionnaires and analysed the infection of viruses and Nosema.Result indicated that acute pesticide and pollutant poisoning could be excluded as the major causes of the death.DWV infection rate of diseased colonies was significantly higher than that of healthy colonies，however，the BQCV infection rate was opposite.In addition，Nosema ceranae infection rates and spore loads of diseased colonies were significantly higher compared with that of healthy colonies.Our investigation and analysis suggested that multiple virus infections，high DWV and IAPV titers and N.ceranae infection were closely related to the colony losses.Considering the role of Varroa mites in promoting virus proliferation，Varroa destructor might be one of the important indirect causes of the death.Moreover，it is worth noting that almost all apparently healthy colonies were infected with a variety of pathogens，which suggested that the health of these colonies were actually in a serious condition.To prevent similar incidents，efforts should be carried outto decrease infection levels of pathogens.Meanwhile，management manners should be improved to increase the disease resistance of honeybees and the stimulations of environmental adverse factors should be avoided.

Apis mellifera，colony losses，virus，multiple infections，N.ceranae，Varroa destructor

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術體系專項（CARS-45），金華市農(nóng)業(yè)研究計劃項目（2014-2-009）

胡福良，E-mail：flhu@zju.edu.cn