張　麗，張一云，符　洪，王開裕，雷玲芳，王春桃#

（1.海南省中醫(yī)院藥學部，?？凇?70203；2.海南省藥物研究所，?？凇?70216）

·民族醫(yī)藥·

黎藥除濕祛風湯對雞Ⅱ型膠原蛋白誘導關節(jié)炎模型大鼠的保護作用研究Δ

張麗1＊，張一云2，符洪2，王開裕1，雷玲芳1，王春桃2#

（1.海南省中醫(yī)院藥學部，?？?70203；2.海南省藥物研究所，?？?70216）

目的：研究黎藥除濕祛風湯對雞Ⅱ型膠原蛋白誘導關節(jié)炎模型大鼠的保護作用。方法：將60只大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性組和除濕祛風湯高、中、低劑量組［45.9、22.95、11.48 g（生藥）/kg］，除正常組外，其余各組大鼠均以雞Ⅱ型膠原蛋白誘導關節(jié)炎模型。建模后，除濕祛風湯各劑量組大鼠ig相應藥物，正常組和模型組大鼠ig生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥12 d；陽性組大鼠實驗1～3 d ig來氟米特4.5 mg/kg，4～12 d ig來氟米特1.8 mg/kg，每天1次。觀察大鼠關節(jié)病變程度并進行評分，測定關節(jié)腫脹度和血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）和Ⅱ型膠原蛋白抗體水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分、關節(jié)腫脹度及血清中TNF-α、IL-1β、Ⅱ型膠原蛋白抗體水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性組和除濕祛風湯高劑量組大鼠病理評分顯著降低，各給藥組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、Ⅱ型膠原蛋白抗體水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：黎藥除濕祛風湯對雞Ⅱ型膠原蛋白誘導模型大鼠具有一定的保護作用。

黎藥；除濕祛風湯；類風濕性關節(jié)炎；腫瘤壞死因子α；白細胞介素1β；大鼠

類風濕關節(jié)炎（RA）是一種慢性、全身性自身免疫性疾病。該病可能的誘因有身體因素（如勞累、關節(jié)損傷、感染等），生活環(huán)節(jié)潮濕，天氣變化以及精神方面的疾病、創(chuàng)傷等［1］，病理機制尚未完全闡明。滑膜間充質(zhì)細胞、基質(zhì)金屬蛋白酶和破骨細胞是RA患者關節(jié)破壞的3種主要細胞［2］。活化的滑膜細胞具有永生性、侵襲性，直接侵蝕關節(jié)軟骨，釋放大量腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）等促炎因子，從而誘發(fā)或加速RA的形成［3-4］。

黎族驗方濕祛風湯主要由黃連藤、膽木、雅能樹、龍骨楓、渴撲、蘇木、松筋藤等18種黎族藥材組成，該方由五指山海南黎族民間醫(yī)藥研究協(xié)會提供。其具有祛風除濕、通絡除痹、治療風濕關節(jié)痛的功效［5］。因本方為驗方，雖然臨床應用療效顯著，但無藥效學實驗依據(jù)。因此，在本研究中，作者擬以雞Ⅱ型膠原蛋白誘導關節(jié)炎（CIA）大鼠模型（此模型的發(fā)病機制與人RA的發(fā)病機制相似），并以來氟米特片為陽性藥物，考察濕祛風湯對RA的藥效學作用，為傳統(tǒng)黎族經(jīng)驗方提供更科學的依據(jù)，為未來黎族藥物研發(fā)奠定實驗基礎。

1　材料

1.1儀器

YLS-7C足趾容積測量儀（河南益陽儀器廠）；KHB-ST360酶標儀（上?？迫A儀器廠）；DT5-2離心機（北京時代北利離心機有限公司）；AUW220D電子天平（日本島津公司）。

1.2藥材、藥品與試劑

黃連藤、膽木、雅能樹、龍骨楓、渴撲、蘇木、松筋藤等18種藥材均由五指山海南黎族民間醫(yī)藥研究協(xié)會采集、提供，經(jīng)海南大學黃世滿教授鑒定均為真品；來氟米特片（蘇州長征-欣凱制藥有限公司，批號：13070310，規(guī)格：10 mg/片；雞Ⅱ型膠原蛋白（美國Sigma公司）；IL-1β、Ⅱ型膠原蛋白抗體、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國TSZ公司）；水為生理鹽水，其余試劑均為分析純。

1.3動物

健康SD大鼠60只，♀，體質(zhì)量（200±50）g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心［生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013-0002］。

2　方法

2.1除濕祛風湯的制備

按方中組成稱取相應藥材，共計255 g。加5倍量水煎煮30 min，過濾，收集濾液；濾渣再加5倍量水煎煮30 min；合并2次濾液，濃縮至藥液體積為110 ml，即得。

2.2動物造模、分組與給藥

2.2.1造模取50只大鼠于背部sc雞Ⅱ型膠原蛋白（0.5 mg/ml），每只0.9～1.0 ml，分5～8點注射，復制CIA型關節(jié)炎模型。致炎后7 d，再ip相同劑量藥物并通過左足底sc雞Ⅱ型膠原蛋白（0.1 ml/只），以加強免疫攻擊（此時大鼠可見明顯過敏反應，如腹部收縮、背部拱起、左足立即變紅）。致炎18 d后，大鼠左足明顯紅腫，提示造模成功。

2.2.2分組造模后將造模大鼠隨機分為模型組、陽性組和除濕祛風湯高、中、低劑量組，每組10只；另取10只正常大鼠作為正常組。

2.2.3給藥除濕祛風湯高、中、低劑量組大鼠分別ig除濕祛風湯45.9、22.95、11.48 g/kg（給藥量按生藥計，按體表面積換算，分別為人臨床用量的10、5、2.5倍），每天1次，連續(xù)12 d；陽性組大鼠在實驗前3 d按4.5×10-3g/kg（按人體劑量給予負荷劑量50 mg算）ig來氟米特片溶液，實驗第4～12 d按1.8×10-3g/kg（按人體劑量給予維持劑量每次20 mg）ig來氟米特片溶液，每天1次，連續(xù)12 d；正常組和模型組大鼠按1 ml/100 g ig生理鹽水，每天1次，連續(xù)12 d。

2.3指標考察

2.3.1關節(jié)炎指數(shù)評分給藥當日（1 d）開始，觀察各組大鼠后肢關節(jié)病變程度。采用關節(jié)炎指數(shù)積分法，參考文獻［6］對病變進行評分：0分代表關節(jié)無紅腫；1分代表關節(jié)有紅色斑點或輕度腫脹；2分代表關節(jié)中度腫脹；3分代表關節(jié)嚴重腫脹；4分代表關節(jié)嚴重腫脹且不能負重；5分代表關節(jié)腫脹且變形。關節(jié)炎指數(shù)評分越高，表示關節(jié)炎癥狀越嚴重。記錄給藥第1天（1 d）、給藥第6天（6 d）及第12天（12 d）各組大鼠后肢關節(jié)病理評分，最后評分為大鼠左、右后足的病理評分之和。

2.3.2足腫脹度末次給藥1 h后，用10%戊巴比妥鈉（2 ml/只）將大鼠深度麻醉，稱體質(zhì)量（g），用足腫脹度儀測量各組大鼠后足踝關節(jié)以下的容積（ml），計算腫脹度［腫脹度=足容積（ml）/體質(zhì)量（100 g）］。

2.3.3生化指標在麻醉后大鼠的下腔靜脈取血，使用一次性人體靜脈血樣采集容器收集血液，分離血清，-20℃保存，備用。ELISA法測定血清中抗Ⅱ型膠原蛋白抗體、TNF-α和IL-1β水平，具體操作按相應試劑盒說明書進行。計算藥物對炎性因子及抗體的抑制率［抑制率=（模型組指標水平-給藥組指標水平）/（模型組指標水平-正常組指標水平）×100%］。

2.4統(tǒng)計學方法

3　結(jié)果

3.1各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分結(jié)果

給藥1 d時，與模型組比較，各給藥組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分幾乎一致，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。給藥6 d時，模型組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分升高，其余各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分較模型組均有一定抑制，但各組間差無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。給藥12 d時，模型組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分繼續(xù)升高，其余各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分較模型組均有所降低，其中陽性組和除濕祛風湯高劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分結(jié)果見表1。

表1　各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分結(jié)果（±s，n=10）Tab 1　Arthritis index of joint in rats of each group（±s，n=10）

表1　各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分結(jié)果（±s，n=10）Tab 1　Arthritis index of joint in rats of each group（±s，n=10）

注：與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

給藥12 d 4.2±0.84 2.6±0.55＊＊2.8±0.45＊3.0±0.71 3.2±0.84組別模型組陽性組除濕祛風湯高劑量組除濕祛風湯中劑量組除濕祛風湯低劑量組劑量，g/kg 關節(jié)炎指數(shù)評分4.5×10-3或1.8×10-345.9 22.95 11.48給藥1 d 3.4±0.55 3.2±0.45 3.4±0.55 3.4±0.55 3.4±1.14給藥6 d 3.8±0.45 3.0±0.71 3.2±0.84 3.4±0.55 3.4±1.14

3.2各組大鼠足腫脹度測定結(jié)果

正常組大鼠左、右后足腫脹度一致，屬于正常狀態(tài)。與正常組比較，模型組大鼠左、右后足腫脹度升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性組和除濕祛風湯高劑量組大鼠左后足腫脹度降低（P＜0.05或P＜0.01），右后足腫脹度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠足腫脹度測定結(jié)果見表2。

表2　各組大鼠足腫脹度測定結(jié)果（±s，n=10，ml/100g）Tab 2　Degree of foot swelling in rats of each group（±s，n=10，ml/100g）

表2　各組大鼠足腫脹度測定結(jié)果（±s，n=10，ml/100g）Tab 2　Degree of foot swelling in rats of each group（±s，n=10，ml/100g）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

右后足0.57±0.07 0.83±0.07＊0.72±0.09 0.74±0.09 0.77±0.10 0.76±0.11組別正常組模型組陽性組除濕祛風湯高劑量組除濕祛風湯中劑量組除濕祛風湯低劑量組劑量，g/kg 4.5×10-3或1.8×10-345.9 22.95 11.48左后足0.58±0.07 1.26±0.18＊0.88±0.14##1.00±0.14#1.02±0.15 1.11±0.16

3.3各組大鼠血清中炎癥因子測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性組和除濕祛風湯高、中劑量大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；除濕祛風湯低劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平測定結(jié)果見表3。

3.4各組大鼠血清中Ⅱ型膠原蛋白抗體含量測定結(jié)果

正常組比較，模型組大鼠血清中Ⅱ型膠原蛋白抗體含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，陽性組和除濕祛風湯高、中劑量組大鼠血清中Ⅱ型膠原蛋白抗體含量顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）；除濕祛風湯低劑量組大鼠血清中Ⅱ型膠原蛋白抗體含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠血清中Ⅱ型膠原蛋白抗體含量測定結(jié)果見表4。

表3　各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平測定結(jié)果（±s，n= 10）Tab 3　Serum levels of TNF-α and IL-1β in rats of each group（±s，n=10）

表3　各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平測定結(jié)果（±s，n= 10）Tab 3　Serum levels of TNF-α and IL-1β in rats of each group（±s，n=10）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

78.5 74.3 71.7 42.5組別正常組模型組陽性組除濕祛風湯高劑量組除濕祛風湯中劑量組除濕祛風湯低劑量組TNF-α含量，pg/ml 37.42±4.75 72.42±2.56＊48.39±10.07#47.18±3.75##57.74±13.84 58.39±12.35抑制率，%抑制率，% 0 0 68.7 72.1 41.9 40.1 IL-1β含量，pg/ml 8.24±0.37 11.63±1.05＊8.97±0.68##9.11±0.33##9.20±0.78##10.19±0.89

表4　各組大鼠血清中Ⅱ型膠原蛋白抗體含量測定結(jié)果（±s，n=10）Tab 4　Serum content of typeⅡcollagen antibody in rats of each group（±s，n=10）

表4　各組大鼠血清中Ⅱ型膠原蛋白抗體含量測定結(jié)果（±s，n=10）Tab 4　Serum content of typeⅡcollagen antibody in rats of each group（±s，n=10）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01 Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

61.0 49.0 44.8 0組別正常組模型組陽性組除濕祛風湯高劑量組除濕祛風湯中劑量組除濕祛風湯低劑量組劑量，g/kg 抑制率，% 4.5×10-3或1.8×10-345.9 22.95 11.48Ⅱ型膠原蛋白抗體，pg/ml 8.37±0.73 12.96±1.33＊10.16±0.69##10.71±0.86#10.90±0.58 13.06±2.96

4　討論

目前，常用的關節(jié)炎動物模型主要有Ⅱ型膠原蛋白誘導的關節(jié)炎模型（CIA型）和完全弗氏佐劑誘導的佐劑性關節(jié)炎動物模型（AA型）兩種。CIA模型［2］在病理學的誘因及變化上與人RA更為相似，更適合作為關節(jié)炎模型［3］，故在本實驗中筆者用此模型進行RA的研究。造模后，可見成模大鼠關節(jié)嚴重紅腫、變形，無法正常利用關節(jié)站立，提示造模成功。在此模型中，Ⅱ型膠原蛋白誘導產(chǎn)生的免疫失衡是導致軟骨損傷的誘因，因此大鼠體內(nèi)的Ⅱ型膠原蛋白抗體含量與RA癥狀呈正相關。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中Ⅱ型膠原蛋白抗體含量顯著增加，表明造模成功；除濕祛風湯高、中劑量組大鼠血清中Ⅱ型膠原蛋白抗體含量顯著減少，表明用藥后關節(jié)炎癥狀得到改善；然而除濕祛風湯低劑量組大鼠血清中Ⅱ型膠原蛋白抗體水平與模型組接近，表明此劑量下無治療作用。

來氟米特片作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，是當前應用于類風濕性關節(jié)炎較廣泛的藥物，具有療效好、起效快、不良反應較輕的優(yōu)點［7］。其機制為抑制嘧啶合成途徑，從而抑制淋巴細胞活化增殖能力［8］，降低免疫球蛋白、炎性因子釋放等，因此筆者在本實驗中以其為陽性對照藥。

TNF-α是一種促炎因子，主要通過巨噬細胞表達，具有刺激免疫細胞轉(zhuǎn)化、誘發(fā)新生血管生成的作用，其與軟骨結(jié)構(gòu)的破壞相關［3］。因此，市面上開發(fā)出了一系列針對TNF-α的單抗抑制劑［9］，旨在通過抗體結(jié)合從而降低血清中TNF-α水平，緩解關節(jié)炎性反應，然而卻存在潛在的感染及腫瘤風險［10］。而針對IL-1的抑制劑主要通過拮抗作用降低IL-1水平，IL-1Ra是IL-1的受體拮抗劑［11］，注射外源IL-1Ra便能明顯減輕關節(jié)軟骨破壞。在本實驗中發(fā)現(xiàn)黎藥處方能顯著地抑制TNF-α、IL-1β水平，表明該方具有較強的調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能，可能通過恢復體內(nèi)各免疫系統(tǒng)之間拮抗作用而發(fā)揮作用，尤其針對IL-1β的作用非常明顯，達到閾值的給藥劑量（在低劑量與中劑量之間）便能非常顯著地抑制IL-1β產(chǎn)生，能夠直接保護關節(jié)軟骨及抑制后續(xù)炎癥的發(fā)展。從對TNF-α及IL-1β的作用效果來看，本黎藥處方中劑量在降低關節(jié)炎損害的同時，又無過多增加感染及腫瘤的風險，是一種風險較低的RA藥物。

關節(jié)滑膜、軟骨及骨損傷是關節(jié)炎3個不同程度的損傷等級，Ⅱ型膠原蛋白作為軟骨標志物，其中有許多抗原表位能夠誘發(fā)產(chǎn)生抗體，活化的B淋巴細胞產(chǎn)生的Ⅱ型膠原蛋白抗體是軟骨破壞的一個重要因素［12］，其可被IL-1系列所刺激活化。在實驗中，模型組血清內(nèi)的Ⅱ型膠原蛋白抗體含量明顯升高，而黎藥的高、中劑量均能明顯地抑制大鼠血清中Ⅱ型膠原蛋白抗體含量，與來氟米特片除濕祛風湯的藥效作用在同一水平。這表明該方通過抑制IL-1β的產(chǎn)生能很好地減少Ⅱ型膠原蛋白的體內(nèi)含量，有助于維持關節(jié)軟骨組織的穩(wěn)定。

綜上，雖目前尚不得知本黎藥處方是否具有恢復骨關節(jié)、軟骨及滑膜組織再生的作用，需要更進一步研究確定，但本研究可證實此黎藥處方是一種優(yōu)良的、能夠明確抑制RA發(fā)展的民族藥方。

［1］鄭希龍，甘炳春，孫偉，等.“材”類黎藥資源的傳統(tǒng)利用［J］.世界科學技術：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2004，16（2）：313.

［2］趙宏艷，王燕，肖誠，等.不同品系、不同性別對大鼠CIA發(fā)病情況的比較研究［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2010，16（9）：761.

［3］潘磊，杜文喜，盧建華.膠原誘導性和佐劑性大鼠關節(jié)炎模型的比較［J］.山西中醫(yī)學院學報，2013，14（4）：12.

［4］宋珊珊，張玲玲，魏偉.實驗性關節(jié)炎動物模型建立及病理機制研究進展［J］.中國藥理學通報，2011，27（12）：1 648.

［5］Irarrazabal CE，Williams CK，Ely MA，et al.Activator protein-contributes to high NaCl-induced increase in tonicity-responsive enhancer/osmotic response element-binding protein transactivating activity［J］.J Biol Chem，2008，285 （5）：2 554.

［6］何國雄，梁清華，楊波，等.膠原誘導性關節(jié)炎大鼠滑膜組織醛縮酶A表達及痹腫消湯的干預效應［J］.中國臨床摘要，2006，10（47）：103.

［7］Smolen JS，Kalden JR，Scott DL，et al.Efficacy and safety of leflunomide compared with placebo and sulphasalazine in active rheumatoid arthritis：a double-blind，randomised，multicentre trial［J］.Lancet，1999，353（23）：259.

［8］王軍，祖比亞，覃學勇.來氟米特臨床應用進展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2010，10（23）：4 585.

［9］張晶，鐘武，李松.TNF-α抑制劑的研究進展［J］.中國藥物化學雜志，2010，20（4）：310.

［10］ Jackie N，Paul E.Aspects of TNF inhibitor therapy in rheumatoid arthritis［J］.Mod Rheumatol，2010，20（3）：325.

［11］汪潔，岳野，成文翔，等.類風濕性關節(jié)炎與IL-1/IL-1Ra平衡關系的研究進展［J］.中國當代醫(yī)藥，2015，9（12）：30.

［12］Kim WU，Yoo WH，Park W.IgG antibodies to typeⅡcollagen reflect inflammatory activity in patients with rheumatoid arthritis［J］.J Rheumatol，2000，27（3）：575.

（編輯：林靜）

Study on Protective Effects of Li Medicine Chushi Qufeng Decoction on Arthritis Model Rats Induced by Chicken TypeⅡCollagen

ZHANG Li1，ZHANG Yiyun2，F(xiàn)U Hong2，WANG Kaiyu1，LEI Lingfang1，WANG Chuntao2
（1.Dept.of Pharmacy，Hainan Provincial Hospital of TCM，Haikou 570203，China；2.Pharmaceutical Institute of Hainan Province，Haikou 570216，China）

OBJECTIVE：To study the protective effects of Li medicine Chushi qufeng decoction on arthritis model rats.METHODS：60 rats were randomly divided into normal group，model group，positive group and Chushi qufeng decoction high-dose，medium-dose and low-dose groups［45.9，22.95，11.48 g（crude drug）/kg］.Except for normal group，those groups were given chicken typeⅡ collagen to induce arthritis model.After modeling，normal group and model group were given normal saline intragastrically，once a day，for consecutive 12 d；Chushi qufeng decoction groups were given relevant medicine intragastrically；positive group was given leflunomide 4.5 mg/kg on 1st-3rd day and 1.8 mg/kg on 4th-12th day.The degree of joint lesion in rats were scored.The degree of joint swelling was determined as well as the serum levels of TNF-α，IL-1β and typeⅡ collagen antibody.RESULTS：Compared with normal group，arthritis index，degree of joint swelling，the serum levels of TNF-α，IL-1β and typeⅡcollagen antibody increased significantly in model group（P＜0.01）.Compared with model group，pathological score of positive group and Chushi qufeng decoction high-dose group decreased significantly，and serum levels of TNF-α，IL-1β and typeⅡcollagen antibody decreased significantly in treatment groups（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Li medicine Chushi qufeng decoction has certain protective effect on arthritis model rats induced by chicken typeⅡcollagen.

Li medicine；Chushi qufeng decoction；Rheumatoid arthritis；TNF-α；IL-1β；Rat

R943

A

1001-0408（2016）22-3088-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.19

海南省中藥現(xiàn)代化專項項目（No.2015ZY18）

＊副主任中藥師。研究方向：醫(yī)院藥學、中藥制劑。電話：0898-66224599。E-mail：1047559396@qq.com

副主任藥師。研究方向：藥品檢驗、藥品質(zhì)量標準。電話：0898-66832918。E-mail：1721170395@qq.com

2016-03-04

2016-05-16）