王如瀟，劉曉英，羅宗龍，李　卓，王立偉，蘇鴻雁*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理　671000；2.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理　671003）

蒼山黑龍溪旱季和雨季水生絲孢菌資源比較研究

王如瀟1，劉曉英1，羅宗龍2，李卓2，王立偉2，蘇鴻雁2*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；2.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理671003）

目的：調(diào)查黑龍溪中水生絲孢菌資源并比較其在旱季和雨季有何異同。方法：2013年3月和7月從黑龍溪中采集沉水腐木各50份，采用保濕培養(yǎng)法對水生真菌進行培養(yǎng)，基于形態(tài)學(xué)特征對水生真菌進行鑒定。結(jié)果：共分離鑒定出48種水生絲孢菌，旱季30種，雨季23種，旱季和雨季共有種5種，共有種分別為Ellisembia bambusicola、Helicosporium guianense、Helminthosporium velutinum、Phaeoisaria clematidis、Rhinocladiella schulzerii。旱季水生絲孢菌多樣性指數(shù)明顯高于雨季水生絲孢菌多樣性指數(shù)（3.67 vs 2.32）。結(jié)論：黑龍溪中水生絲孢菌的多樣性與季節(jié)變化有關(guān)，旱季中獲得的水生絲孢菌更多。

水生絲孢菌；黑龍溪；旱季；雨季；沉水腐木

［DOI］10. 3969 / j. issn. 2096-2266. 2016. 06. 015

水生真菌中子囊菌及其無性型種類繁多，而淡水無性型真菌的形態(tài)多樣〔1〕。SHEARER等〔2〕將淡水無性型真菌劃分為3類，分別是水生絲孢菌、需氣水生絲孢菌和其他水生絲孢菌。已有研究表明，水生真菌在水生生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色，而作為水生真菌一大類群的水生絲孢菌在水生生態(tài)系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要作用〔3〕。從1942年INGOLD報道第一個水生絲孢菌至今已有七十多年歷史〔4〕，有大量的水生絲孢菌被發(fā)現(xiàn)，在中國發(fā)現(xiàn)并報道的就有416種，其中98種來自云南〔5〕。

在熱帶和溫帶地區(qū)已有關(guān)于真菌的季節(jié)性發(fā)生的研究，其研究對象主要是小溪中腐葉上的真菌〔6〕。也有關(guān)于腐木上真菌的季節(jié)性發(fā)生的研究〔7〕。NIKOLCHEVA等〔8〕采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法研究季節(jié)與水生絲孢菌多樣性的相關(guān)性。HO等〔9〕研究濕熱干冷氣候?qū)Υ笃覝蛑谐了旧险婢郝涞挠绊?。余永年等?0〕對北京地區(qū)水霉科真菌的季節(jié)性分布進行了調(diào)查研究。云南省也有相關(guān)報道，楊發(fā)蓉、丁驊孫、羅晶等〔11-14〕學(xué)者對滇池、洱海、程海水體中的水生真菌類群分布以及其多樣性與季節(jié)變化的相關(guān)性進行了研究。

蒼山位于南亞熱帶和中亞熱帶交匯處，受水平和垂直地帶性氣候的雙重影響，生物具有明顯的多樣性特征。蒼山東坡歷年各月平均氣溫，最熱月和最冷月均出現(xiàn)在7月和1月，7月平均最高溫為24.5℃。蒼山降雨豐富，年均降雨量1 851.6 mm，其中5～10月份的降雨量占全年的84%。東坡年日照數(shù)達2 305.8 h，干季（11～4月）平均日照數(shù)為6.5 h以上，而雨季（5～10月）平均日照數(shù)只有4.4～6.6 h。迄今為止，幾乎沒有學(xué)者對蒼山水生絲孢菌資源進行過全面的調(diào)查與分類。本項目主要調(diào)查黑龍溪中水生絲孢菌資源并比較其在旱季雨季中有何異同。

1　材料和方法

1.1沉水腐木的采集2014年3月和7月分別沿黑龍溪下游往上游隨機采集腐木，選擇浸泡時間較長，腐爛程度良好，直徑1～5 cm、長20～30 cm的腐木各50份。采集好的腐木裝入自封塑料袋中，記錄采樣時間、地點。帶回實驗室進行保濕培養(yǎng)。

1.2培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL；MEA培養(yǎng)基：麥芽浸膏30 g，大豆蛋白胨3 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL；WA培養(yǎng)基：瓊脂條18 g，蒸餾水1 000 mL。以上培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃，20 min）后冷卻至50℃（以不燙手為宜）時加入終濃度為100 μg/mL氨芐青霉素混勻，倒入平板備用。

1.3樣品的觀察保濕培養(yǎng)1周后，將樣品置于GL-99BI連續(xù)變倍體視鏡下進行觀察，在所觀察到的目標菌株附近插上大頭針作為標記。對所觀察到的絲孢菌用Nikon-SMZ1000進行外部形態(tài)拍照。以無菌水、甘油等作為浮載劑，對所觀察到的真菌進行制片，在OLYMPUS BX51顯微鏡下進行繪圖、拍照、測量。

1.4水生絲孢菌的單孢分離在體式鏡下鎖定目標菌株，用削尖的無菌牙簽將分生孢子挑取下來，轉(zhuǎn)移到WA培養(yǎng)基上，保證每皿至少有7個分生孢子。室溫培養(yǎng)，24 h后進行觀察，將萌發(fā)的孢子轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基或MEA培養(yǎng)基上，用保鮮膜封口，室溫培養(yǎng)，另挑取萌發(fā)的孢子制片，用OLYMPUS BX51顯微鏡拍照。以上操作均在無菌條件下進行。定期檢查菌落的生長情況，若發(fā)現(xiàn)污染及時純化。

1.5拼圖使用Photoshop軟件對菌種的外部形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)圖片進行拼圖。

1.6形態(tài)學(xué)鑒定對真菌在基質(zhì)上的著生情況、菌絲、孢子梗、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子著生情況及分生孢子形態(tài)等特征進行鑒定。主要參照相關(guān)文獻〔15-17〕對所得到的水生絲孢菌進行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.7數(shù)據(jù)分析本研究采用香農(nóng)-威納指數(shù)（H）來比較黑龍溪中不同季節(jié)的水生絲孢菌多樣性。采用辛普森相似指數(shù)（S）評估兩個季節(jié)中水生絲孢菌群落的相似指數(shù)，S=0表示不相似，S=1表示完全相似。各參數(shù)公式如下所示：

水生絲孢菌檢出率（%）=（某個物種檢出次數(shù)/樣品總數(shù)）×100%。

式中：Ni=第i個種的檢出次數(shù)，N=所有種的檢出次數(shù)，lnPi=Pi的自然對數(shù)。

S=2c/a+b，其中，a=黑龍溪中旱季水生絲孢菌種數(shù)，b=黑龍溪中雨季水生絲孢菌種數(shù)，c=兩個季節(jié)中共有的水生絲孢菌種數(shù)。

2　結(jié)果

在這次研究中，共鑒定出48種水生絲孢菌，其中旱季30種，雨季23種。旱季中出現(xiàn)頻率較高的種為Helicosporium guianense（14%）、Sporidesmium adscendens（10%）、Helminthosporium velutinum（8%）。雨季中出現(xiàn)頻率較高的種為Monodictys cerebriformis （8%）、Phaeoisariaclematidis（8%）、S.sp.（8%）。見表1。

表1　黑龍溪中沉水腐木上水生絲孢菌檢出率

續(xù)表1

兩個季節(jié)都出現(xiàn)的有5種，分別是Ellisembia bambusicola、H.guianense、H.velutinum、P.clematidis、Rhinocladiella schulzerii。除了R.schulzerii（2%）的檢出率相同外，其余4種的檢出率皆不同。黑龍溪中旱季和雨季水生絲孢菌群落的辛普森相似指數(shù)為0.19，顯示出水生絲孢菌群落在這兩個季節(jié)的相似性較低。比較兩個季節(jié)的水生絲孢菌多樣性指數(shù)旱季水生絲孢菌多樣性指數(shù)明顯高于雨季水生絲孢菌多樣性指數(shù)（3.67 vs 2.32）。見表2。

表2　黑龍溪中沉水腐木上水生絲孢菌物種數(shù)、真菌多樣性指數(shù)及相似指數(shù)

3　討論

楊發(fā)蓉等〔11-13〕在研究中指出，在滇池和洱海中旱季和雨季的水生真菌類群和數(shù)量差異較大，旱季的水生真菌類群和數(shù)量明顯多于雨季。此次研究結(jié)果與之相同。水生真菌群落和真菌多樣性的影響因素有很多，溫度〔18〕、植被〔19-20〕、氣候帶〔21-23〕、水污染〔24〕、人為干擾〔20〕、真菌生長基質(zhì)〔25〕等。此次研究選取的研究地點為蒼山黑龍溪，氣候帶和植被對水生絲孢菌多樣性的影響不大。有研究顯示黑龍溪入湖口水質(zhì)旱季雨季皆為劣Ⅴ類，出山口水質(zhì)旱季為Ⅰ類而雨季為Ⅱ類〔26〕，相比較而言，旱季水質(zhì)較雨季水質(zhì)要好。已有研究表明，污染對真菌群落結(jié)構(gòu)有影響，而對真菌多樣性的影響不大〔20-27〕。雨季中水生絲孢菌多樣性和物種數(shù)低于旱季可能與降雨頻繁有關(guān)，旱季水流量少且緩慢，雨季水流量大、流速快，雨水沖刷可能造成游動孢子數(shù)量減少或死亡〔13〕。不同季節(jié)黑龍溪中水的溫度也不同，已有研究證實溫度對物種豐富度和多樣性有影響〔18〕。實驗結(jié)果顯示黑龍溪中水生絲孢菌在旱季和雨季的相似性較低，并且旱季的多樣性指數(shù)高于雨季。因此，黑龍溪中水生絲孢菌多樣性受季節(jié)的影響。

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〔Abstract〕Objective：To investigate the diversity of freshwater hyphomycetes from Heilong Stream and compare their differences in occurrence during the dry season and rainy season.Methods：50 samples were collected from each season，moist chamber incubation methodwasusedtoincubatethefungiandthefunguswereidentifiedbasedonthemorphologicalcharacters.Results：Atotalof48speciesof freshwater hyphomycetes were identified：30 species from dry season，23 species from wet season.Ellisembia bambusicola，Helicosporium guianense，Helminthosporiumvelutinum，Phaeoisariaclematidis，Rhinocladiellaschulzeriiwerefoundduringboththeseasons.Thediversity index of freshwater fungi at dry season is higher than wet season（3.67 vs 2.32）.Conclusion：The diversity of freshwater hyphomycetes in HeilongStreamcloselyrelatedtotheseasonchangingandmorespeciesdiversitywasobservedduringdryseason.

〔Key words〕freshwater hyphomycetes；Heilong Stream；dry season；wet season；submerged decayed wood

（責(zé)任編輯李楊）

Comparative Study of Freshwater Hyphomycetes Resource in Heilong Stream during the Rainy Season and Dry Season in Cangshan Mountain at Dali

Wang Ruxiao1，Liu Xiaoying1，Luo Zonglong2，Li Zhuo2，Wang Liwei2，Su Hongyan2*
（1.Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.College of Agriculture and Biology Science，Dali University，Dali，Yunnan 671003，China）

Q948

A

2096-2266（2016）06-0062-04

國家自然科學(xué)基金資助項目（31060019；31460015）；云南省中青年學(xué)術(shù)帶頭人資助項目（2012HB042）

2015-11-06

2016-01-14

王如瀟，碩士研究生，主要從事微生物及疾病研究.

蘇鴻雁，教授.