秦秀秀， 李愛峰， 孫愛玲， 柳仁民

(聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東聊城 252059)

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半制備型高效液相色譜法分離純化吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿

秦秀秀， 李愛峰， 孫愛玲， 柳仁民*

(聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東聊城 252059)

[目的]建立從吳茱萸中分離純化吳茱萸堿和吳茱萸次堿的半制備型高效液相色譜法。[方法]采用C18柱(250 mm×25.4 mm I.D.,10 μm)，甲醇-水為流動(dòng)相，考察了流動(dòng)相的組成、流速和上樣量對(duì)分離效果的影響，確定了適宜的色譜條件：流動(dòng)相為甲醇-水(70∶30,V/V)，流速為25 mL/min，上樣量為60 mg，檢測波長為225 nm。[結(jié)果]一次分離即可得到2種單體成分，經(jīng)紫外光譜和核磁共振波譜分析得到鑒定為吳茱萸堿和吳茱萸次堿，經(jīng)高效液相色譜法檢測其純度分別為99.2%和99.7%。[結(jié)論]與傳統(tǒng)的分離方法相比，半制備型高效液相色譜法具有高效、簡便、快速的特點(diǎn)，適用于吳茱萸中主要有效成分的快速制備。

半制備高效液相色譜；分離純化；吳茱萸；吳茱萸堿；吳茱萸次堿

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸 (Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.)、石虎 (Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.var.officinalis (Dode) Huang) 或疏毛吳茱萸 (Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.var.bodinieri (Dode) Huang) 的干燥近成熟果實(shí)[1]，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉等功效，用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸及五更泄瀉[1]。吳茱萸含有生物堿、揮發(fā)油、檸檬苦素、黃酮和氨基酸等多種成分[2]，其中最主要的有效成分為吳茱萸堿和吳茱萸次堿，為吳茱萸質(zhì)量控制的主要指標(biāo)。

近年來，有關(guān)吳茱萸中活性成分分離純化的研究報(bào)道日益增多，其中硅膠柱層析是廣泛采用的方法[3-4]，該法可以處理大量樣品，但具有不可逆吸附嚴(yán)重、操作繁瑣、分離效率低等缺點(diǎn)。也有學(xué)者使用高速逆流色譜法分離純化吳茱萸中的生物堿及檸檬苦素類成分[5-6]，該法雖然消除了不可逆吸附，但在選擇兩相溶劑系統(tǒng)時(shí)由于缺乏理論指導(dǎo)而較為困難。因此，建立一種相關(guān)成分的高效分離純化方法具有十分重要的意義。該文建立了半制備型高效液相色譜法(semi-preparative high performance liquid chromatography,SP-HPLC)從吳茱萸中分離純化吳茱萸堿和吳茱萸次堿的新方法，一步分離即可得到吳茱萸堿和吳茱萸次堿2種單體成分，利用紫外光譜和核磁共振波譜分析對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，利用高效液相色譜法對(duì)其純度進(jìn)行了測定。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器。Gelaipu高效液相色譜系統(tǒng)(成都格萊普科技有限責(zé)任公司)，包括GLP3250高壓輸液泵、UV-3292紫外檢測器及格萊普色譜工作站；Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，包括G1311A高壓輸液泵、G1315B DAD檢測器、G1332A在線脫氣機(jī)和Agilent HPLC色譜工作站；Mercury Plus 400 NMR核磁共振儀(美國瓦里安公司)。C18柱(250 mm×25.4 mm I.D.,10 μm，成都格萊普科技有限責(zé)任公司)，Spherigel ODS C18柱(250 mm×4.6 mm I.D.,5 μm，大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司)。

1.1.2試劑。用于吳茱萸中有效成分提取的溶劑(乙醇、甲醇)為分析純(天津市化學(xué)試劑三廠)，用于SP-HPLC分離純化和HPLC分離分析的甲醇為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠)，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.1.3藥材。吳茱萸藥材購于聊城市利民大藥店，經(jīng)鑒定為蕓香科植物吳茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.的干燥近成熟果實(shí)。

1.2方法

1.2.1粗提物的制備。稱取吳茱萸藥材500 g，粉碎至30目，用5倍量無水乙醇超聲提取3次，每次60 min，將提取液過濾、合并，減壓濃縮得粗提物6.0 g，用200 mL甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，備用。

1.2.2樣品的HPLC分析。色譜柱：Spherigel ODS C18柱 (250 mm×4.6 mm I.D.,5 μm)；流動(dòng)相:甲醇-水 (75∶25,V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：225 nm；柱溫：室溫；上樣量：5 μL。

1.2.3SP-HPLC分離純化。色譜柱：C18柱 (250 mm×25.4 mm,Fuji SMB 100-10填料)；流動(dòng)相：甲醇-水(70∶30,V/V)；流速：25 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：225 nm；上樣量：2 mL (含粗提物60 mg)。在該條件下對(duì)吳茱萸粗提物進(jìn)行分離純化，在15.7～16.2 min處手動(dòng)收集第1個(gè)餾分，在26.5～27.5 min處手動(dòng)收集第2個(gè)餾分，經(jīng)減壓濃縮除去溶劑。1.2.4化合物的純度測定及結(jié)構(gòu)鑒定。SP-HPLC分離所得的餾分經(jīng)HPLC法進(jìn)行純度檢測，色譜條件見“1.2.2”?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)經(jīng)UV及NMR得以鑒定。

2　結(jié)果與討論

2.1HPLC分析條件的優(yōu)化首先應(yīng)建立合適的分析方法對(duì)吳茱萸藥材的提取物和在分離純化過程中得到的單體成分進(jìn)行分析。該研究使用Spherigel ODS C18柱(250 mm×4.6 mm I.D.,5 μm)，考察了流動(dòng)相的組成及洗脫模式對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明：當(dāng)使用甲醇-水 (75∶25,V/V) 為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min時(shí)，主要目標(biāo)化合物可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲得良好的分離。對(duì)主要目標(biāo)化合物的紫外光譜進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在225 nm均具有較強(qiáng)的吸收，因此選擇225 nm 為檢測波長。在該條件下，吳茱萸粗提物的HPLC分析圖見圖1。

注：1為吳茱萸堿；2為吳茱萸次堿。Note:1.Evodiamine; 2.Rutaecarpine.圖1　吳茱萸粗提物(a)及2種目標(biāo)化合物(b、c)的HPLC分析圖Fig.1　HPLC chromatograms of the crude extracts from Fructus Evodiae (a) and two target compounds (b,c)

2.2SP-HPLC分離條件的優(yōu)化

2.2.1流動(dòng)相的組成。使用C18柱，在上樣量為1 mL (含30 mg粗提物)、流動(dòng)相的流速為25 mL/min，檢測波長為225 nm的條件下，考察了流動(dòng)相的組成對(duì)分離效果的影響，結(jié)果見圖2。

注：a:甲醇-水 (65∶35,V/V)， b.甲醇-水 (70∶30,V/V),C.甲醇-水 (75∶25 V/V)。Note: a.Methanol-water (65∶35,V/V), b.Methanol-water(70∶30,V/V); c.Methanol-water (75∶25 V/V).圖2　流動(dòng)相的組成對(duì)分離效果的影響Fig.2　Effects of composition of mobile phase on separation

由圖2可知，當(dāng)使用65%甲醇為流動(dòng)相時(shí)分離度大，但分離時(shí)間太長，增大流動(dòng)相中甲醇的比例可以使分離時(shí)間明顯縮短，與此同時(shí)，吳茱萸堿與其附近的雜質(zhì)峰之間的分離度也逐漸下降。當(dāng)使用70%甲醇為流動(dòng)相時(shí)，分離度及分離時(shí)間均比較理想，故選擇甲醇-水(70∶30,V/V)為流動(dòng)相。

2.2.2流動(dòng)相的流速。使用C18柱，甲醇-水(70∶30,V/V)為流動(dòng)相，上樣量為1 mL(含30 mg粗提物)，檢測波長為225 nm，考察了流動(dòng)相的流速對(duì)分離效果的影響，結(jié)果見圖3。

注：a.20 mL/min,b.25 mL/min; c.30 mL/min。Note:a.20 mL/min; b.25 mL/min; c.30 mL/min.圖3　流動(dòng)相的流速對(duì)分離效果的影響Fig.3　Effects of flow rate of mobile phase on separation

由圖3可知，隨著流速的增加，分離時(shí)間逐漸縮短，吳茱萸堿與其附近的雜質(zhì)峰之間的分離度也逐漸下降。當(dāng)流速為25 mL/min時(shí)，分離度及分離時(shí)間均比較令人滿意，故選擇25 mL/min為最佳流速。

2.2.3上樣量。采用體積超載的方式，固定樣品溶液的濃度為30 mg/mL，通過改變上樣體積考察了上樣量對(duì)分離效果的影響，結(jié)果見圖4。

注：a.30 mg; b.60 mg; c.90 mg。Note:a.30 mg; b.60 mg; c.90 mg.圖4　上樣量對(duì)分離效果的影響Fig.4　Effects of sampling amount on separation

由圖4可知，隨著上樣量的增加，相鄰兩組分間的分離度減小，當(dāng)上樣量到達(dá)一定量時(shí)，相鄰組分無法實(shí)現(xiàn)分離。當(dāng)上樣量大于90 mg時(shí)，吳茱萸堿與其附近的雜質(zhì)峰分離度較低，無法保證吳茱萸堿的純度。同時(shí)考慮產(chǎn)品的純度及分離效率，選擇上樣量為60 mg。

綜上所述，使用C18柱分離純化吳茱萸中活性成分的最佳試驗(yàn)條件如下：甲醇-水(70∶30,V/V)為流動(dòng)相，流速為25 mL/min，上樣量為60 mg，檢測波長為225 nm。經(jīng)過一次分離即可得2種成分，質(zhì)量分別為25.2 mg和9.4 mg。

2.3化合物的純度檢測及結(jié)構(gòu)鑒定經(jīng)SP-HPLC分離純化收集的餾分經(jīng)減壓濃縮后真空干燥，得到黃色和淡黃色粉末，取適量粉末用甲醇溶解，按照“1.2.2”的分析HPLC色譜

條件進(jìn)行分析，峰面積歸一化法檢測純度分別為99.2%和99.7%，HPLC分析圖見圖1b～c。

化合物的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR和13C-NMR得到了鑒定，相關(guān)數(shù)據(jù)如下：

化合物1:1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ ppm:8.35 (1H,br,N-H),8.18～7.17 (8H,m,Ar-H),5.96 (1H,s,H-3),4.91,3.32 (1H,each,m,H-5),3.02(2H,m,H-6),2.54 (3H,s,N-CH3);13C-NMR (100 MHz,CDCl3) δ ppm:164.7 (C-21),150.2 (C-15),136.5 (C-13),132.5 (C-17),128.5 (C-18),128.2 (C-19),125.4 (C-2),122.4 (C-16),121.9 (C-8),121.9 (C-10),120.4 (C-20),118.8 (C-11),117.9 (C-7),117.9 (C-9),110.9 (C-12),68.4 (C-3),39.1 (C-5),36.4 (N-CH3),19.3 (C-6)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]中列出的吳茱萸堿的核磁數(shù)據(jù)一致，故該化合物鑒定為吳茱萸堿。

化合物2:1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ ppm:9.65(1H,br s,N-H),8.37-8.34 (1H,m,Ar-H),7.19-7.12 (7H,m,Ar-H),4.64 (2H,t,H-5),3.25 (2H,t,H-6)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) δ ppm:162.2 (C-21),147.8 (C-15),145.6 (C-3),138.9 (C-13),135.0 (C-17),127.8 (C-2),127.1 (C-18),126.9 (C-19),126.1 (C-16),121.8 (C-8),121.1 (C-10),121.1 (C-20),120.5 (C-9),120.5 (C-11),118.7 (C-7),112.7 (C-12),41.7 (C-5),20.1 (C-6)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]中列出的吳茱萸次堿的核磁數(shù)據(jù)一致，故該化合物鑒定為吳茱萸次堿。

3　結(jié)論

`該文使用C18柱，甲醇-水為流動(dòng)相，通過考察流動(dòng)相的組成、流速及上樣量對(duì)分離效果的影響，優(yōu)化了分離條件，建立了SP-HPLC分離純化吳茱萸中有效成分的方法。在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，一次分離可以得到2種高純度化合物，經(jīng)UV和NMR鑒定分別為吳茱萸堿和吳茱萸次堿。與傳統(tǒng)的分離純化方法相比，該法具有高效、快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)，適合于吳茱萸中主要有效成分的快速制備。

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Separation and Purification of Evodiamine and Rutaecarpine from Fructus Evodiae by Semi-preparative High Performance Liquid Chromatography

QIN Xiu-xiu,LI Ai-feng,SUN Ai-ling,LIU Ren-min*

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Liaocheng University,Liaocheng,Shandong 252059)

[Objective] To establish a semi-preparative high performance liquid chromatography (SP-HPLC) method for separation and purification of evodiamine and rutaecarpine from Fructus Evodiae.[Method] A C18column (250 mm×25.4 mm I.D.,10 μm) was used as separation column and methanol-water as the mobile phase.The optimum separation conditions were obtained through investigating the effects caused by the composition and flow rate of the mobile phase and the sampling amount.The suitable conditions were listed as follows:methanol-water (70∶30,V/V) as mobile phase at the flow rate of 25 mL/min,the sampling amount was 60 mg,and the detection wavelength was set at 225 nm.[Result] Under the above conditions,evodiamine and rutaecarpine were obtained through one-step separation.The purities of the two compounds were determined as 99.2% and 99.7% by high performance liquid chromatography (HPLC).The chemical structures of evodiamine and rutaecarpine were identified by ultraviolet spectrum (UV) and nuclear magnetic resonance (NMR) analysis.[Conclusion] Comparing with the traditional separation method,the SP-HPLC method developed in the study has many advantages such as high efficiency,facility,and high speed.And it is suitable for fast preparation of active components from Fructus Evodiae.

Semi-preparative high performance liquid chromatography; Separation and purification; Fructus Evodiae; Evodiamine; Rutaecarpine

秦秀秀(1991- )，女，山東汶上人，碩士研究生，研究方向：藥物分離與分析研究。*通訊作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事分離科學(xué)研究。

2016-05-30

S 567

A

0517-6611(2016)22-111-03