張　穎，王麗華，陳藝洋，王　蕾，周長健，付嘉偉，范新會

（東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱　150030）

一株DBP高效降解菌的篩選及降解特性研究

張穎，王麗華，陳藝洋，王蕾，周長健，付嘉偉，范新會

（東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱150030）

鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）屬鄰苯二甲酸酯（PAEs），DBP與基質間非共價鍵連接，是環(huán)境污染物。由于DBP性質相對穩(wěn)定，微生物降解是其降解主要途徑。試驗從荒廢污染設施土壤中成功篩選一株DBP高效降解菌，經(jīng)16S rRNA比對與劍菌（Ensifer sp.）相似度為99%，將其命名為DNB-S2。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)DNB-S2最適生長條件為：溫度35℃；pH 7.0；DBP濃度500 mg·L-1；轉速125 r·min-1。DNB-S2能利用高濃度DBP，在500 mg·L-1DBP濃度下，48 h內(nèi)降解率達95%。底物廣譜性研究發(fā)現(xiàn)DNB-S2可降解PAEs家族中其他污染物鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）。為PAEs污染的生物降解提供理論基礎和技術支持。

鄰苯二甲酸酯（PAEs）；鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）；降解菌；廣譜性

網(wǎng)絡出版時間2016-8-24 15:04:00[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160824.1504.012.html

張穎,王麗華,陳藝洋,等.一株DBP高效降解菌的篩選及降解特性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2016,47(8):46-54.

Zhang Ying,Wang Lihua,Chen Yiyang,et al.Study on isolation and identification of a Di-n-butyl phthalate(DBP)-degrading strain and its degradation characteristics[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(8):46-54.(in Chinese with English abstract)

鄰苯二甲酸酯（Phthalate ester，PAEs），又稱酞酸酯，是工業(yè)生產(chǎn)中塑料增塑劑。PAEs廣泛應用于化妝品、汽車內(nèi)飾、家具、食品包裝、醫(yī)療器械、手套、兒童玩具生產(chǎn)等[1-2]。鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）是PAEs中重要化合物，是工業(yè)產(chǎn)品（柔性PVC材料）和家居產(chǎn)品（油漆、膠水、農(nóng)用塑料薄膜等）重要添加劑[3-4]。DBP除具有生殖毒性。神經(jīng)毒性外，還具有致癌、致畸、致突變毒性，目前，中國、美國等國家和國際機構將DBP列為環(huán)境優(yōu)先控制污染物[5-8]。

由于DBP與PVC樹脂間并非以共價鍵而以范德華力連接，DBP在塑料制品中呈游離狀態(tài)，在塑料生產(chǎn)和使用過程易于擴散到環(huán)境中[9]，成為一種普遍環(huán)境污染物。目前，DBP導致的環(huán)境污染及對人類健康造成危害已受到廣泛關注。DBP是一種持久性有機污染物，在自然條件下光解和水解緩慢。微生物降解被認為最重要的PAEs類污染物降解方式[10]。目前，國內(nèi)外研究者已篩選出大量DBP降解菌，如節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）[6]、假單胞菌（Pseudomonas sp.）[11]、抗輻射菌（Deinococcus sp.）[12]、粘質沙雷氏菌C9（Serratia marcescens C9）[13]、紅球菌（Rhodococcus sp.）[14-15]、分枝桿菌（Mycobacterium sp.）[16]、大頭茶菌（Gordonia sp.）[17]、農(nóng)桿菌（Agro?bacterium sp.）[18]等。關于劍菌屬細菌（Ensifer sp.）降解DBP的研究尚未見報道。

本研究在污染較為嚴重荒廢設施土壤中分離鑒定一株DBP高效降解菌，分析其生長及降解特性，通過株降解廣譜性研究，了解該菌株實際修復適用范圍，為PAEs污染的生物降解提供理論基礎和技術支持，為污染環(huán)境的生物修復和清潔生產(chǎn)提供新方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試土壤

黑龍江省哈爾濱市郊區(qū)荒廢污染的設施土壤中，取5～20 cm深土壤樣品200 g，盛入已滅菌防水紙袋內(nèi)，取回后于-80℃冰箱保存。

1.1.2供試培養(yǎng)基

無機鹽液體培養(yǎng)基（g·L-1）：K2HPO4·3H2O 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，NaCl，1.0 g，CaCl2·2H2O 0.075 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.01 g，NH4NO30.5 g，pH 7.0，121℃（1.05 MPa）條件下滅菌20 min；LB液體培養(yǎng)基（g·L-1）：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，pH 7.0，121℃（1.05 MPa）條件下滅菌20 min。固體培養(yǎng)基分別在上述液體培養(yǎng)基中加瓊脂15～20 g·L-1。

1.1.3主要儀器與設備

HZS-H恒溫水浴搖床（哈爾濱東聯(lián)公司）；萬分之一電子天平（北京賽多利斯）；滅菌鍋（上海申安公司）；UV-1800型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；Microfμge 22R低溫離心機（德國Beck?man公司）；LC-20ADXR型液相色譜儀（日本島津公司）；PCR儀（北京東勝）。

1.2方法

1.2.1DBP降解菌富集分離

DBP降解菌分離參照耿印印等方法[19]。取土樣100 g于已滅菌大三角瓶中，在瓶中加入新鮮塑料碎屑。加入適量無菌水使土壤含水量保持在50%，放入恒溫箱中富集兩周，定期通氣，并定期加水攪拌保證土壤濕度不變。稱取富集土壤樣品10 g，置于已滅菌150 mL三角瓶中，加入100 mL無菌水，放置于150 r·min-1搖床中震蕩20 min，制成菌懸液。采用梯度壓力馴化法培養(yǎng)，配置以DBP作為唯一碳源和能源固體無機鹽培養(yǎng)基，通過稀釋涂平板法初篩，選擇生長狀態(tài)良好，形態(tài)不同菌落，多次平板劃線法復篩，直至分離得到單菌落。

1.2.216S rRNA基因序列PCR擴增、測序及分析

1.2.2.1降解菌株DNA提取

采用無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株24 h，10 000 r·min-1離心3 min，去除上清液，收集菌體，重復2～3次，獲得足夠菌體。加入450 μLTEN、0.25 mol·L-1EDTA（pH 8.0）50 μL，振蕩均勻，加入50 μL 10% SDS，5 μL蛋白酶K（20 mg·L-1），混勻后置于37℃恒溫水浴鍋水浴1 h。加入100 μL（5 mol·L-1）NaCl，80 μL CTAB/NaCl溶液混勻，置于65℃水浴鍋水浴10 min。加入相同體積酚/氯仿/異戊醇（25 ?24 ?1）混合液，混勻后12 000 r·min-1離心5 min，取上清液。加入0.6倍體積異丙醇后混勻，室溫放置10 min后，再12 000 r·min-1離心10 min。70%乙醇洗滌沉淀，12 000 r·min-1離心5min，棄去上清液，吹干乙醇，溶于25 μL TE緩沖液中，獲取最終DNA，0.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

1.2.2.216S rRNA的PCR擴增

PCR反應體系如下：DNA模板1 μL；引物各1 μL；dNTP（10 mmol·L-1）1 μL；10×Taq buffer 5 μL；DNA Taq聚合酶1 μL；加雙蒸水（ddH2O）至50 μL。

選用16s通用引物：27f：5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3'；1522r：5'AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 3'。PCR擴增程序如下：95℃預變性5 min；94℃變性1 min；50℃退火1 min；72℃延伸1 min；設置25個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存30 min。1%瓊脂糖電泳檢測擴增反應產(chǎn)物，產(chǎn)物片段大小約1 400 bp。PCR產(chǎn)物由上海生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.2.3測序分析

將測序得到長度為1 430 bp序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中16S rRNA基因序列作比較，選取比對結果最高菌株。將測序獲得序列與相關文獻中已報道的PAEs降解菌序列運用MEGE 5.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3細菌生理生化試驗

LB瓊脂平板劃線接種，35℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況及菌落特征，生理生化試驗參照文獻[20-21]鑒定，主要包括甲基紅試驗、淀粉水解試驗及部分生化鑒定等。

1.2.3.1細菌生長量測定

以蒸餾水作對照，采用紫外可見分光光度計在600 nm波長下測定培養(yǎng)液光密度值。

1.2.3.2DBP含量測定

向待測菌液中加入等量正己烷分層萃取，漩渦振蕩器充分搖勻后，超聲提取20～30 min，離心后取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后收集濾液，采用液相質譜（LC-MS）法測定DBP含量。

LC-MS條件：色譜柱：Kinetex C18（150 mm× 3.0 mm，2.6 μm，100 A）；流動相：甲醇（0.1%FA）；流速：200 μL·min-1；進樣量10 μL。

1.2.4不同環(huán)境因素對菌株生長及降解DBP影響

將分離純化得到菌株接種于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后收集菌體，無機鹽培養(yǎng)基重懸，調(diào)整菌懸液OD600=1.0，作為種子液備用。以3%接菌量將種子液接種于30 mL無機鹽培養(yǎng)基中，以接種滅活菌株為對照，分別設定不同培養(yǎng)溫度、初始pH、初始DBP濃度及搖速。每隔3 h取樣，測定細菌生長量OD600，并用LC-MS法檢測溶液中DBP殘留濃度，每個試驗數(shù)據(jù)重復3次，取平均值，DBP降解率計算公式如下：

DBP降解率（%）=（DBP初始濃度-DBP殘留濃度）/DBP初始濃度×100%

溫度設定（℃）：20、25、30、35、40；pH設定：5、6、7、8、9、10；DBP濃度（mg·L-1）：100、200、500、800、1 000、2 000；搖速設定（r·min-1）：100、125、150、200、250。

通過單因素試驗，應用正交試驗方法確定菌株最佳生長及降解培養(yǎng)條件。

1.2.5菌株對不同PAEs降解情況

將3%菌株種子液接種于30 mL無機鹽培養(yǎng)基中，分別加入500 mg·L-1的DBP、DMP、DEP和DEHP，125 r·min-1、35℃搖床培養(yǎng)72 h，按上述方法測定比較菌株對不同PAEs底物及500 mg·L-1DBP培養(yǎng)基中生長及降解情況。

2　結果與分析

2.1菌株DNB-S2生理生化特征

菌株革蘭氏染色顯示為陰性菌。菌株生理生化特性測定結果如表1所示，淀粉、明膠水解試驗，甲基紅試驗，V-P反應均為陽性，硫化氫、尿素、吲哚、檸檬酸鹽試驗均為陰性，可利用DBP為唯一碳源和能源生長繁殖。

2.2菌株16S rRNA基因序列相似性分析

以菌株DNB-S2基因組DNA為模板作PCR擴增，然后瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物經(jīng)回收、T/A克隆后送至上海生物工程技術服務有限公司測序，獲得長度為1 446 bp的16S rDNA基因片段，NCBI上進行Blast同源性比對，發(fā)現(xiàn)該菌株基因序列與劍菌屬細菌（Ensifer sp.）同源性為99%，將其命名為DNB-S2。將DNB-S2與幾種常見PAEs降解菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。

系統(tǒng)發(fā)育樹上可看出降解菌共分為3大支，分別是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Fir?micutes）和放線菌（Actinobacteria），DNB-S2歸為變形菌門。

2.3菌株生長及對DBP降解特性研究

2.3.1培養(yǎng)溫度對菌株生長及降解DBP影響

培養(yǎng)溫度對DNB-S2降解DBP影響情況如圖2所示，當培養(yǎng)溫度為30～40℃時，菌株生長和DBP降解情況較好，35℃時達到最高菌株生長量和DBP降解率，48 h可降解91.4%以上DBP；而當培養(yǎng)溫度低于25℃或高于45℃時，菌株生長明顯受抑制，菌株對DBP降解能力明顯降低。

表1　供試菌株生理生化試驗Table 1　Physiological and biological characterizations of strains

2.3.2初始pH對菌株生長及降解DBP影響

初始pH對DNB-S2降解DBP影響情況如圖3所示，菌株較適宜培養(yǎng)pH為6.0～8.0，當pH為7.0時，菌株對DBP降解效果最佳，降解率可達92.3%以上，當培養(yǎng)液初始pH小于5.0或大于9.0時，菌株生長緩慢，DNB-S2對DBP降解能力受抑制。

圖1　菌株DNB-S2 16S rDNA基因序列與其他PAEs降解菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1　Phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene sequences of strain DNB-S2 and other PAEs degradation bacteria

2.3.3初始DBP濃度對菌株生長及降解DBP影響

初始DBP濃度對DNB-S2降解DBP影響情況如圖4所示。

由圖4可知，隨底物濃度增加，生長曲線和降解曲線均呈先增后減趨勢。當?shù)孜餄舛刃∮?00 mg·L-1時，DNB-S2生長和降解能力較弱，當?shù)孜餄舛葹?00～1 000 mg·L-1時，生長量達最高值，細菌生長量為0.89～0.91，此時降解率在500 mg· L-1時達最大值95%。底物濃度為800、1 000 mg· L-1時，雖然菌株生長量達最大值，但底物初始濃度較大，對應降解率大幅下降。當?shù)孜餄舛冗_2 000 mg·L-1時，菌株仍可生長，但生長受抑制，降解率降到最低。

圖2　 溫度對菌株DNB-S2生長及DBP降解率影響Fig.2　Effect of temperature on the growth and DBP degradation rate of DNB-S2

圖3　pH對菌株DNB-S2生長及DBP降解影響Fig.3　Effect of pH on the growth and DBP degradation rate of DNB-S2

圖4　初始DBP濃度對菌株DNB-S2生長及DBP降解影響Fig.4　Effect of DBP conccentration on the growth and DBP degradation rate of DNB-S2

圖5　 搖速對菌株DNB-S2生長及DBP降解影響Fig.5　Effect of shaking speed on the growth and DBP degradation rate of DNB-S2

2.3.4搖速對菌株生長及降解DBP影響

搖速對菌株降解DBP影響情況如圖5所示，相對于初始pH、溫度及初始DBP濃度，搖速對菌株生長量及降解率影響最弱，搖速在100～250 r· min-1時，培養(yǎng)48 h后菌株細菌生長量達0.64～0.90，菌株對DBP降解率達68.9%～89.4%，搖速為125 r·min-1時，菌株生長量及對DBP降解率達到峰值。

2.3.5菌株DNB-S2最佳降解曲線

在單因素試驗基礎上，為確定菌株最佳降解曲線，進行四因素三水平L9（34）正交試驗，選擇不同溫度、pH、初始DBP濃度及搖速為組分，以菌株對DBP降解率為考查目標，優(yōu)化降解條件。正交試驗設計見表2。

由表3可知，各因素對菌株降解DBP效率均有一定影響。根據(jù)極差值（R），各因素對DBP降解率影響程度排序為：初始DBP濃度（C）>溫度（A）>pH （B）>搖速（D）。根據(jù)污染物降解效果確定固定化成球最佳組合為A2B2C2D2，即菌株最佳降解條件：溫度35℃、pH 7.0、初始DBP濃度500 mg·L-1、搖速125 r·min-1。

表2　菌株DNB-S2正交試驗設計Table 2　DNB-S2 strain orthogonal design

表3　 菌株DNB-S2正交設計結果Table 3　Orthogonal design results of DNB-S2

以最佳降解條件培養(yǎng)菌株，測定菌株生長量及對DBP降解率，以時間為橫坐標，細菌生長量及DBP濃度為縱坐標，繪制生長及降解曲線，如圖6所示。菌株生長量與降解能力呈一定正相關，從整體來看生長曲線呈S型，符合一般群落結構生長趨勢；從降解曲線整體來看，在DBP降解過程中，其濃度和時間對數(shù)之間具有良好線性關系，48 h可將500 mg·L-1的DBP去除95%以上。

2.3.6菌株對不同PAEs降解情況分析

菌株對DMP、DEP、DBP和DEHP降解情況如表4所示，表明菌株亦可利用其他幾種常見PAEs類化合物生長，對DMP、DEP和DBP利用情況較好，對DEHP利用情況稍弱，因DEHP烷基碳鏈較長，菌株對其利用情況不如對烷基碳鏈較短的DMP、DEP或DBP降解效果。

圖6 菌株DNB-S1生長及降解曲線Fig.6　Growth and degradation curve of strain DNB-S1

表4　菌株鄰苯二甲酸酯利用廣譜性Table 4　PAEs substrate diversity of strain DNB-S2

3　討論與結論

DBP的辛醇-水分配系數(shù)（Kow）較高，水溶性低，屬于親脂性有機污染物，易溶于有機溶劑，因此其易于向固體沉積物和生物體轉移，在土壤中積累，威脅人類健康。DBP在自然環(huán)境中光解、水解速度緩慢。因此，微生物降解是DBP降解主要方式。研究表明，DBP好氧降解比厭氧降解更有效[3]。目前，已有大量降解菌從土壤、沉積物、活性污泥、紅樹林中分離，DBP刺激土著微生物抗脅迫能力。PAEs降解菌中，高效降解菌并不常見，大量降解菌僅能降解單一污染物，降解菌株在生物修復中具有局限性。因此，篩選具有高效降解能力且降解多種污染物的菌株具有重要意義。

本研究篩選的高效降解菌可在高濃度DBP存在下生長，500 mg·L-1DBP濃度下，48 h內(nèi)降解量超過95%，最高耐受DBP濃度達2 000 mg·L-1。本研究對菌株DNB-S2與已報道的幾種常見PAEs降解菌作系統(tǒng)發(fā)育進化樹比較其親緣關系。進化樹分析發(fā)現(xiàn)，進化樹共分三支，分別是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌（Actinobacteria）[22-25]，而DNB-S2屬于變形菌門（Proteobacteria）劍菌屬（Ensifer），劍菌屬能降解多種污染物，如農(nóng)藥（苯醚甲環(huán)唑[26-27]、乙草胺[28]），殺蟲劑（甲拌磷[29]、噻蟲嗪[30]），同時可降解石油[31]、尼古丁[32]和二苯亞胂酸[33]等物質。

本試驗底物廣譜性試驗表明，DNB-S2菌株除有效降解DBP外，對其他3種常見PAEs類污染物DMP、DEP和DEHP降解作用明顯。菌株生長情況良好，證明PAEs類污染物對菌株無毒害作用，菌株對DEHP降解效果不如對烷基碳鏈較短的DBP、DMP或DEP降解效果，這可能是因DEHP具有更低水溶性、烷基碳鏈較長，具有更高的辛醇-水比（logKow=7.5）[10]，與陳湖星等研究結果一致[34]，其篩選出一株能以鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）為唯一碳源生長的不動桿菌（Acinetobacter）命名為HS-B1，該菌能在以DMP、DEP、DBP、DEHP等PAEs類化合物為唯一碳源無機鹽培養(yǎng)基中生長，HS-B1菌株對烷基碳鏈較短的DMP、DEP、DBP利用較快，而對長鏈DEHP利用較慢。關于DBP降解菌報道較多，如周洪波等從底泥中篩選出能以DBP為唯一碳源生長的鞘氨醇菌（Sphingomonas）命名為XJ1，該菌株雖可利用DMP等一系列PAEs類化合物生長，但降解能力有限[35]。金雷等在長期受垃圾污染的土壤中篩選到一株類芽胞桿菌（Paenibacillus sp.）的DBP降解菌，命名為S-3，該菌株降解速率及能力較弱，在5 d內(nèi)對100 mg·L-1DBP降解率達82.7%[36]。Wu等首次報道農(nóng)桿菌（Agrobacterium sp.）降解DBP，將其命名為JD-49，可降解DBP濃度最大為300～400 mg·L-1，48 h內(nèi)降解率達96%，但未提及該降解菌廣譜性降解能力[18]。與以往DBP降解菌相比，本研究篩選得到的DNB-S2是具有降解廣譜性的高效降解菌株。

圖6　 菌株DNB-S1生長及降解曲線Fig.6　Growth and degradation curve of strain DNB-S1

本研究篩選的DBP高效降解菌經(jīng)16S rRNA基因片段NCBI比對，鑒定為劍菌（Ensifer sp.），命名為DNB-S2。該菌株生理生化特性測定結果為：淀粉、明膠水解試驗、甲基紅試驗、V-P反應均為陽性，硫化氫、尿素、吲哚、檸檬酸鹽試驗均為陰性。DNB-S2的最佳降解條件為：溫度35℃、pH 7.0、初始DBP濃度500 mg·L-1、搖速125 r·min-1，在該培養(yǎng)條件下，降解菌48 h對500 mg·L-1DBP降解率高達95%以上。同時DNB-S2具有廣譜降解性能，除可降解高濃度DBP，也可降解DMP和DEP，對長鏈DEHP也有一定降解作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)劍菌屬能高效利用PAEs，豐富PAEs降解菌數(shù)據(jù)庫，在PAEs污染生物修復方面具有應用潛力。

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Study on isolation and identification of a Di-n-butyl phthalate(DBP)-degrading strain and its degradation characteristics/

ZHANG Ying,WANGLihua,CHEN Yiyang,WANG Lei,ZHOU Changjian,FU Jiawei,FAN Xinhui(School of Resources and Environmental Sciences,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

Di-n-butyl phthalate(DBP),which belonged to the family of PAEs,was widely used as one of plasticizers.As DBP was not chemically bonded with the resin,so DBP had become ubiquitous in the environment.However,metabolic breakdown of DBP by microorganisms played a major role in the environmental degradation of DBP because of its low environmental hydrolysis and photolysis rates.In the present study,an efficient bacterial strain was isolated from PAEs-contaminated soil,which was identified as Ensifersp.with the highest 16S rDNA gene similarity of 99%.The optimal growth condition of DNB-S2 was as following:temperature 35℃,pH 7.0,DBP concentration 500 mg·L-1,shaking speed 125 r·min-1.Strain DNB-S2 was able to degrade 500 mg·L-1DBP by more than 95%within 48 h.The results of substrate diversity indicated that DNB-S2 could also degrade DMP,DEP and DEHP.The search not only provided important basic data and technical support for the biodegradation of PAEs pollution,but also offered a new direction for bioremediation of contaminated environments and clean production.

PAEs;DBP;degradation bacteria;substrate diversity

X172

A

1005-9369（2016）08-0046-09

2016-03-21

國家自然科學基金項目（31470550）

張穎（1972-），女，教授，博士，博士生導師，研究方向為環(huán)境污染生物修復。E-mail:zhangyinghr@hotmail.com