李益鋒，張朝輝，姜放軍，鄧沛怡

（湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410127）

湖南省石漠化地區(qū)常綠藤本植物抗寒性研究初探

李益鋒，張朝輝，姜放軍，鄧沛怡

（湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410127）

為研究目前應(yīng)用于石漠化治理的常綠藤本植物抗寒適應(yīng)性，以6種2 a生離體枝條為試材，測(cè)定不同低溫處理葉片的電解質(zhì)滲出率，可溶性蛋白質(zhì)和丙二醛（MDA）的含量，以及超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性。結(jié)果表明：低溫脅迫下6種常綠藤本植物葉片的電解質(zhì)滲出率呈明顯的“S”型上升趨勢(shì)，擬合Logistic方程得出6種常綠藤本植物半致死溫度（LT50）；隨著溫度的降低，葉片內(nèi)MDA含量持續(xù)上升，可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，絡(luò)石和皺葉忍冬的CAT活性一直維持較低水平而其他常綠藤本植物顯著高于對(duì)照，POD活性總體呈上升趨勢(shì)。根據(jù)隸屬函數(shù)法，求出隸屬函數(shù)值，判定6種常綠藤本植物均可在湖南用于石漠化治理，而常春油麻藤和皺葉忍冬在湘北及湘西應(yīng)用時(shí)需謹(jǐn)慎。

石漠化治理；低溫脅迫；常綠藤本植物；抗寒性指標(biāo)；隸屬函數(shù)法

湖南省石漠化土地面積14 788.62 km2，潛在石漠化土地面積14 359.68 km2，兩者占全省土地總面積的17.6%，石漠化嚴(yán)重程度在西南8省區(qū)市中排在第四位，成為湖南省最為嚴(yán)重的生態(tài)問(wèn)題之一［1-2］。木質(zhì)藤本植物根系較深，是石漠化山地生態(tài)重建的理想植物材料［3-5］，因此開(kāi)展適合石漠化地區(qū)植被恢復(fù)的藤本植物抗寒性研究，篩選出適合該地區(qū)極端低溫條件下生長(zhǎng)的藤本植物，對(duì)石漠化治理具有重要的理論意義和實(shí)際價(jià)值。對(duì)于藤本植物的抗寒性，已有不少學(xué)者做了研究［6-10］，從分析結(jié)果看，同種藤本植物抗寒性指標(biāo)各不相同，說(shuō)明不同區(qū)域的藤本植物可能存在較大的基因型差異。研究在形態(tài)學(xué)觀察［4］和抗旱性篩選基礎(chǔ)上［11-12］選擇6種湖南本地常綠木質(zhì)藤本，分析其抗寒性相關(guān)指標(biāo)變化趨勢(shì)和規(guī)律，為湖南省石漠化>治理藤類選擇、栽培養(yǎng)護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料

扶芳藤［Euonymus fortunei （Turcz.） Hand.-Mazz.］、常春藤［Hedera nepalensis K. Koch var. sinensis （Tobl.）Rehd.］、常春油麻藤（Mucuna sempervirens Hemsl.）、絡(luò)石［Trachelospermum jasminoides （Lindl.） Lem.］、薜荔（Ficus pumila Linn.）、皺葉忍冬（Lonicera rhytidophylla Hand.-Mazz.）。6種藤本植物均為湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院藤本植物研究所2 a生扦插苗。經(jīng)過(guò)低溫鍛煉后，于2016年1月下旬選擇生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的植株進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)方法

下午約6：00，截取每種藤本植物中部發(fā)育正常的枝條60根，自來(lái)水洗凈、擦干后隨機(jī)平分為6組，密封入保鮮袋中，分別放入6臺(tái)植物生長(zhǎng)箱及控溫冰箱中進(jìn)行人工冷凍處理，溫度設(shè)置為5、0、-5、-10、-15、-20和-25℃，24 h后，置于5℃冰箱內(nèi)回溫恢復(fù)0.5～3 h。對(duì)不同處理的枝條，選取中部正常的功能葉片，混合采樣，每個(gè)處理取20片，分別測(cè)定相關(guān)抗寒生理指標(biāo)。

1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定［13］各處理隨機(jī)選取10片葉片，用直徑1 cm的打孔器打成規(guī)格相同的小圓片，用去離子水沖洗3次，再用濾紙吸干表面水分。將打好的小圓片每份3片放入50 mL的具塞試管中，加入25 mL去離子水，在ZD-3震蕩器上浸泡2 h，用DDSJ-308A型電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率，然后將樣品管置于沸水中煮沸15 min，使質(zhì)膜完全破壞，取出在自來(lái)水中冷卻至室溫后再次測(cè)定電導(dǎo)率，以不加葉片只加去離子水測(cè)定作空白對(duì)照。電解質(zhì)滲出率=（處理電導(dǎo)率值-本底電導(dǎo)率值）/（處理煮沸后電導(dǎo)率值-本底電導(dǎo)率值）×100。

1.3.2可溶性蛋白質(zhì)（Prot）含量的測(cè)定采用考馬斯亮蘭法［13］。

1.3.3丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取葉片組織0.4 g，按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定各指標(biāo)。試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，使用Infinite 200Pro酶標(biāo)儀測(cè)定，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4數(shù)據(jù)分析

綜合各項(xiàng)指標(biāo)用隸屬函數(shù)法進(jìn)行抗寒性評(píng)價(jià)［14］。各指標(biāo)變化具有連續(xù)性質(zhì)，故采用連續(xù)性質(zhì)的隸屬度函數(shù)。相對(duì)電導(dǎo)率、MDA采用降型分布函數(shù)：U（Xij）=1-（Xij-Ximin）/（Ximax-Ximin）；可溶性蛋白、SOD、POD和CAT采用升型分布函數(shù)：（Xij-Ximin）/（Ximax-Ximin），其中U（Xij）表示各指標(biāo)的隸屬度值，Xij為各材料的指標(biāo)測(cè)定值，Ximin、Ximax為各材料中第i項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)的最小值和最大值。采用SAS 6.12進(jìn)行方差分析，Excel 2007作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1低溫脅迫對(duì)常綠藤本植物電解質(zhì)滲透的影響

植物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受到低溫脅迫后會(huì)遭受破壞，破壞的程度隨低溫脅迫的加劇而增加，因此，比較相同低溫脅迫水平下不同植物電解質(zhì)外滲率的大小，是間接評(píng)價(jià)植物應(yīng)對(duì)低溫脅迫能力的一種有效途徑［15-16］。常綠藤本植物葉片經(jīng)不同低溫處理后，電解質(zhì)滲出率（見(jiàn)表1）呈明顯的“S”型上升趨勢(shì)。溫度降低到0℃，對(duì)大部分種類葉片電解質(zhì)的滲出率影響不大；溫度降低到0℃以下時(shí)，6種常綠藤本植物對(duì)低溫脅迫的反應(yīng)分為三類。第一類為前急后緩型，如常春油麻藤和皺葉忍冬在-5～0℃躍變，電解質(zhì)滲出率分別增加了156.17%、191.38%、，以后變化趨緩；第二類為平緩型，如常春藤和薜荔，電解質(zhì)滲出率變化相對(duì)較小，其值在-10～-5℃發(fā)生躍變，分別增加了116.92%、113.01%；第三類為前緩后急型，如扶芳藤和絡(luò)石的電解質(zhì)滲出率在前期變化不大，-15～-10℃躍變，其值分別增加了156.66%、116.77%。

表1　低溫脅迫對(duì)6種藤本植物葉片電解質(zhì)滲出率的影響

對(duì)電解質(zhì)滲出率配以Logistic方程，得出6種常綠藤本植物的半致死溫度LT50（見(jiàn)表1）。結(jié)果顯示，多數(shù)在電解質(zhì)滲出率出現(xiàn)躍變后達(dá)到半致死溫度，其中前急后緩型的LT50最高，在-10～-9℃之間；平緩型的居中，在-20～-15℃之間；前緩后急型的LT50最低，在-24～-22℃之間，充分顯示了植物抗寒力與電解質(zhì)滲透率的相關(guān)性，抗寒力越強(qiáng)的藤本植物其電解質(zhì)滲透率躍變溫度及LT50越低。

2.2低溫脅迫下常綠藤本植物可溶性蛋白含量的變化

圖1表明，常綠藤本植物可溶性蛋白含量隨著溫度的下降總體表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，但不同種類對(duì)低溫的反應(yīng)差異極顯著（P＜0.01）。-10℃時(shí)常春油麻藤與常春藤，-15℃時(shí)扶芳藤與絡(luò)石，-20℃時(shí)皺葉忍冬均出現(xiàn)一峰值。常春油麻藤可溶性蛋白含量一直居高，但相對(duì)增幅較?。?12.46%）；扶芳藤與薜荔的可溶性蛋白含量一直最低，相對(duì)增幅分別為513.36%和297.04%；皺葉忍冬對(duì)低溫的反應(yīng)最強(qiáng)烈，相對(duì)增幅最大，達(dá)932.54%。可溶性蛋白含量相對(duì)增幅從大到小依次為皺葉忍冬＞常春藤＞扶芳藤＞絡(luò)石＞薜荔＞常春油麻藤。

2.3低溫脅迫下常綠藤本植物MDA含量的變化

植物在低溫脅迫條件下，細(xì)胞中的活性氧積累發(fā)生膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致其產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生和積累。從圖2可見(jiàn)，常綠藤本植物葉片的MDA含量隨著溫度的降低而持續(xù)上升。其中皺葉忍冬的含量及增幅均顯著高于其他5種，而薜荔則始終處于較低水平；扶芳藤在-5℃出現(xiàn)峰值，-15℃以后增幅較大；常春藤、常春油麻藤與絡(luò)石差異不顯著。植物細(xì)胞中MDA含量增幅越小，說(shuō)明其膜脂過(guò)氧化越少，其抗寒性越強(qiáng)，從丙二醛的含量變化來(lái)看，6種常綠藤本植物中薜荔的抗寒性最強(qiáng)，常春藤、常春油麻藤與絡(luò)石居中，扶芳藤其次，皺葉忍冬最弱。

圖1　低溫對(duì)可溶性蛋白含量的影響

圖2　低溫對(duì)MDA含量的影響

2.4低溫脅迫對(duì)常綠藤本植物SOD活性的影響

SOD活性被認(rèn)為是衡量植物抗寒性高低的重要指標(biāo)，它能清除植物體內(nèi)多余的超氧根陰離子［13］。從圖3可以看出，隨著溫度下降，常綠藤本植物的SOD活性總體表現(xiàn)為先增后降的趨勢(shì)。溫度降到-15℃常春藤、常春油麻藤、薜荔和皺葉忍冬出現(xiàn)峰值，-20℃扶芳藤出現(xiàn)峰值；絡(luò)石的SOD活性最高并一直保持上升趨勢(shì)。就相對(duì)增幅而言，常春油麻藤和皺葉忍冬最大，分別到達(dá)201.03%、201.75%，常春藤和絡(luò)石最小，分別為162.32%、121.34%，扶芳藤和薜荔居中，種類間差異極顯著（P＜0.01）。

2.5低溫脅迫對(duì)常綠藤本植物CAT活性的影響

由圖4可知，經(jīng)低溫脅迫后，6種常綠藤本植物葉片CAT活性變化趨勢(shì)和變化幅度均不相同。0℃以上時(shí)，6種常綠藤本植物葉片CAT活性變幅不大，除薜荔外，其他5種的差異也不顯著（P＞0.05）；0℃以下時(shí)則變幅加劇，種間差異也達(dá)到了極顯著（P＜0.01）。-5～0℃，薜荔和扶芳藤躍變；-10～-5℃，常春油麻藤躍變；-20～-15℃，常春藤躍變，而絡(luò)石和皺葉忍冬的CAT活性一直維持較低水平。

圖3　低溫對(duì)SOD活性的影響

圖4　低溫對(duì)CAT活性的影響

2.6低溫脅迫對(duì)常綠藤本植物POD活性的影響

由圖5可知，經(jīng)低溫脅迫后，6種常綠藤本植物葉片POD活性總體呈上升趨勢(shì)但變化幅度各不相同。扶芳藤、薜荔、常春油麻藤和絡(luò)石的過(guò)氧化物酶活性隨溫度的降低而持續(xù)升高，變幅較大，而常春藤和皺葉忍冬分別在-5℃和-10℃出現(xiàn)一個(gè)峰值，隨后繼續(xù)升高，且相對(duì)變幅最小，分別為347.79%、454.47%。對(duì)6種常綠藤本植物作方差分析表明，種類間及溫度間差異極顯著（P＜0.01）。

圖5　低溫對(duì)POD活性的影響

2.7應(yīng)用隸屬函數(shù)法對(duì)抗寒性的綜合評(píng)價(jià)

植物抗寒性是由眾多數(shù)量、質(zhì)量遺傳基因綜合作用累加的結(jié)果，每一個(gè)與抗寒性有關(guān)的性狀對(duì)抗寒性都起一定的作用，但每種作用都是微效的［17］，用多個(gè)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)藤本植物的抗寒性才較為可靠。因?yàn)楦骺购碇笜?biāo)的性質(zhì)和單位不具可比性，因此，需要對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量化。試驗(yàn)綜合各項(xiàng)指標(biāo)的平均隸屬度（表2），判定6種常綠藤本植物抗寒性強(qiáng)弱的排序?yàn)椋航j(luò)石＞扶芳藤＞常春藤＞薜荔＞常春油麻藤＞皺葉忍冬。

表2　低溫脅迫條件下各測(cè)定指標(biāo)的隸屬函數(shù)值

3 討 論

研究證實(shí)了測(cè)定外滲液電導(dǎo)率的變化可以反映質(zhì)膜的傷害程度和所測(cè)材料抗逆性的大小［13］，是衡量植物抗寒性的可靠指標(biāo)。根據(jù)常綠藤本植物在低溫脅迫逐步加重的過(guò)程中其外滲液電導(dǎo)率的變化快慢，可分為前急后緩、平緩和前緩后急三種類型，抗寒性越強(qiáng)的植物其外滲液電導(dǎo)率在前期的變化越慢。一般來(lái)說(shuō)，在相同低溫脅迫條件下，可溶性蛋白作為植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量越高，植物體的抗寒性也就越強(qiáng)［15］，在試驗(yàn)中，可溶性蛋白含量較高的常春油麻藤的抗寒性比蛋白質(zhì)含量低的薜荔弱，這可能與不同種間對(duì)低溫脅迫的防御機(jī)制不同有關(guān)。

在低溫脅迫條件下，植物往往會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，其產(chǎn)物MDA對(duì)細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性，而CAT和POD是過(guò)氧化氫的解毒劑、CAT和SOD是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的保護(hù)酶［13］，它們活性的變化與MDA的積累可能存在關(guān)系。試驗(yàn)表明，在低溫輕度脅迫條件下，SOD、POD、CAT活性增加，盡管MDA同時(shí)上升，但酶活性的提高加速了氧自由基的清除，酶促防御系統(tǒng)也得到了有效保護(hù)，細(xì)胞傷害較??；隨著脅迫加重，MDA的累積抑制了SOD、POD、CAT的活性，使其下降，喪失了保護(hù)酶促防御系統(tǒng)的功能，造成膜脂過(guò)氧化作用加強(qiáng)，細(xì)胞傷害加大，這可能就是低溫脅迫下植物主要的生理反應(yīng)及損傷機(jī)理。這一反應(yīng)是一個(gè)協(xié)同作用的復(fù)雜過(guò)程，僅以某項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)難以判定其抗寒性的大小，必須進(jìn)行綜合分析。

通過(guò)抗寒性綜合評(píng)價(jià)，經(jīng)研究認(rèn)為這6種常綠藤本植物均可在湘中、湘南地區(qū)用于石漠化治理，不會(huì)發(fā)生凍害；湘北及湘西歷史極端低溫曾低至-10℃以下，常春油麻藤和皺葉忍冬的應(yīng)用需謹(jǐn)慎。

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（責(zé)任編輯：肖彥資）

Preliminary Study on Cold-Resistant Of Ever Green Lianas in Rocky Desertification Area of Hunan

LI Yi-feng，ZHANG Zhao-hui，JIANG Fang-jun，DENG Pei-yi
（Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic College， Changsha 410127， PRC）

In order to study cold resistant adaptability of ever green lianas for application of rocky desertification control， using six species two-year cutting branches as test material， determined electrolyte leakage rate of leaves at different low temperature treatment， the content of soluble protein and malondialdehyde （MDA）， and the activity of superoxide dismutase （SOD）， peroxidase （POD） and catalase （CAT）. The results showed that， electrolyte leakage rate of six species ever green lianas leaves showed a marked “S” type upward trend， and the semi-lethal temperature （L50） of the six species could be calculated according to the Logistic equation； with the decrease of temperature，the content of MDA in leaves increased continuously， and the soluble protein content and SOD activity showed the trend of first increasing and then decreasing， the activity of CAT maintained a low level in Trachelospermum jasminoides and Lonicera rhytidophylla， but in the others， it was significant higher than that in the control， POD activity showed an overall upward trend. According to subordination function method， obtained the value and determined 6 species of ever green lianas can be used for rocky desertification control in Hunan， but Mucuna sempervirens and Lonicera rhytidophylla should be used carefully in the north and west of Hunan.

rocky desertification control； low temperature stress； ever green lianas； cold resistance index； subordination function method

Q945.78

A

1006-060X（2016）08-0031-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.08.010

2016-05-27

湖南省科技計(jì)劃一般項(xiàng)目（2012ZK3115）

李益鋒（1971-），男，湖南益陽(yáng)市人，副教授，從事作物栽培科研與教學(xué)工作。