郝永豐　許迪亮　李明

摘要：研究在飼料中按一定比例添加發(fā)酵豆粕和酶解魚粉對刺參幼苗（Apostichopus ja ponicus）酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響。于投喂后第60d后檢測ACP、AKP、LSZ與SOD活性。結(jié)果顯示，總體上分析用發(fā)酵豆粕替代豆粕比用酶解魚粉替代魚粉對刺參幼苗ACP、AKP的影響要顯著。單獨分析單一因素，各添加組ACP、AKP活性較不添加組均有不同程度的升高，其中用發(fā)酵豆粕替代100%大豆粕組與用酶解魚粉替代50%魚粉組效果最佳。發(fā)酵豆粕組與酶解魚粉組對LSZ活性的影響沒有顯著差異。其發(fā)酵豆粕各個替代組較不替代組LSZ的活力都有不同程度的升高，其中替代75%組最為明顯（P<0.05）。酶解魚粉各個替代組較不替代組也有不同程度的升高，但差異不顯著?？傮w上分析發(fā)酵豆粕組與酶解魚粉組對SOD活性的影響沒有顯著差異。兩者不同替代組較不替代組SOD的活性都有不同程度的升高，但都不顯著。研究表明發(fā)酵豆粕和酶解魚粉替代飼料中的大豆粕和魚粉對刺參幼參的免疫力都有不同程度增強作用。

關(guān)鍵詞：刺參幼苗；發(fā)酵豆粕；酶解魚粉；酸性磷酸酶（ACP）；堿性磷酸酶（AKP）；溶菌酶（LSZ）；超氧化物歧化酶（SOD）

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的刺參平均體重為（3.4±0.26）～（4.5±0.26）g/頭。投喂人工配合飼料，基礎(chǔ)配方見表1。室內(nèi)飼養(yǎng)期間用遮光板控制光照強度，水溫人工控制，飼養(yǎng)期間平均水溫變化在（13.0±0.5）～（15.0±0.5）℃之間。

酶解魚粉的制備參考Buchmann等和Mohr的方法，采用雙酶（胰蛋白酶和木瓜蛋白酶）降解法。以進口鱈魚為原料酶解獲得水解產(chǎn)物干燥而成。通過測定α-氨態(tài)氮含量（甲醛滴定法），最終計算得蛋白水解度在60%，粗蛋白含量為65.0%（占干物質(zhì)），粗脂肪的含量為5.2%（占干物質(zhì)）。

發(fā)酵豆粕制備參照HongKJ的方法。干燥的豆粕浸泡60min，在溫度為60～70℃蒸汽罐里煮1h，然后在室溫下冷卻1h，接種枯草芽孢桿菌和嗜酸乳酸桿菌進行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物在50～60℃干燥3d，粉碎使用，粗蛋白含量43%。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 實驗條件 飼養(yǎng)實驗將240頭刺參分為16組，每組15頭稱重后隨即裝入帶有編號的16個養(yǎng)殖水箱中（90L/箱），編號分別為1～16號。將編號水箱圍養(yǎng)殖池（60m³）圓形排列，向池中加水至池中水面低于箱中水面3～5cm，打開水閥使池中形成定向水流?？刂扑皇垢飨渌疁叵嗖畈怀^0.3℃，且水箱中水溫與池中水溫差距在0.5℃以內(nèi)，保證實驗水箱中的水溫相對恒定。養(yǎng)殖海水為經(jīng)沉淀過濾的海水，由泵房每天監(jiān)測調(diào)節(jié)水溫，將養(yǎng)殖池水溫控制在13～15℃。每天下午14：30開始吸底，換水1/3，換水后進行投喂飼料，飽食投喂，投喂量在5%～10%（吸底時有殘余餌料）。視水質(zhì)情況5～7d刷洗一次水箱。飼養(yǎng)期間DO≥4.0mg/L；NH₄⁺-N≤0.1mg/L；pH=8.2～8.3，飼養(yǎng)期間不充氣。

1.2.2 實驗分組 用發(fā)酵豆粕以不同比例（0%，50%，75%，100%）替代刺參基礎(chǔ)飼料中的豆粕，用酶解魚粉以不同比例（0%，25%，50%，75%）代替飼料中的魚粉。發(fā)酵豆粕各組分別記錄為a1、a2、a3、a4組，酶解魚粉各組分別記錄為b1、b2、b3、b4組?；A(chǔ)飼料配方如表1。實驗采用正交試驗的方法以減少試驗的單元數(shù)。實驗設(shè)計為二因素四水平的正交實驗，所以采用L₁₆（4⁵）正交表。實驗飼料的分組方案和正交實驗表，見表1、2和表3。

1.3 樣品制備

飼養(yǎng)實驗結(jié)束后，實驗刺參幼參經(jīng)3d停食處理后，收集刺參，對每個實驗單元的幼參進行稱重。然后取樣后于冰浴中，用注射器從腹部插入海參體內(nèi)，小心拉動注射器進行抽取，每個個體抽取海參體腔液2mL。離心（12000r/min，4℃，20min），取上清液備用，4℃保存。

1.4 測定方法

1.4.1 SOD活性測定 采用的連苯三酚自氧化法。向內(nèi)徑1cm比色杯中分別加入3mL磷酸鉀鹽緩沖液，20μL酶粗液，10μL鄰苯三酚。在320nm處，每隔30s記錄吸光值，連續(xù)讀數(shù)90s。以10μL鄰苯三酚混合3mL磷酸緩沖液測定連苯三酚自氧化速率，自氧化速率控制O.060～0.070A/min之間。

酶活單位定義：每毫克蛋白每min抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%的酶量定義為一個酶活單位，以U表示。

式中：U·mL^-1：SOD酶活力單位；

AA320：連苯三酚自氧化速率；

△A320：樣液抑制連苯三酚自氧化速率；

V：反應(yīng)液總體積，mL；

V：所加樣液體積，mL；

D：樣液稀釋倍數(shù)。

總活力（U·mg^-1）一單位體積活性（U·mL^-1）×原液體積（mL）/樣品質(zhì)量（mg）

1.4.2 酸性磷酸酶測定（用ACP測定試劑盒） 取三個潔凈試管，分別作為測定管、標準管和空白管。按表4進行操作。

立即混勻，室溫靜置10min，于520nm，1cm光徑，空白管調(diào)零，測各管吸光度值。

定義：100mL體腔液上清液在37℃與基質(zhì)作用30min產(chǎn)生1mg的酚為1個活力單位（U）。

1.4.3 溶菌酶測定（比濁法）

操作步驟：（1）將配制好的應(yīng)用菌液，標準應(yīng)用液及體腔液上清液均放人37℃水浴箱中預(yù)熱5min，使菌液、標準液和體腔液上清液的溫度達到37℃。

（2）取20支試管放入水浴箱中，在試管中各加應(yīng)用菌液2mL，繼續(xù)水浴。

（3）取3只1cm光徑的比色皿，在可見光分光光度計上530nm處，用蒸餾水調(diào)透光度100%，然后倒掉蒸餾水。

（4）將標準應(yīng)用液及樣本0.2mL分別加入洗干凈的比色皿底部，然后快速將37℃水浴箱中預(yù)溫試管里的2mL應(yīng)用菌液迅速倒入裝有0.2mL樣本的比色皿中，（也可用5mL大加樣器吸取以37℃預(yù)溫的應(yīng)用菌液加入比色皿中）。在將37℃預(yù)溫的2mL應(yīng)用菌液倒入比色皿的同時同步地按下秒表，于反應(yīng)5秒時讀出并記錄下透光度T0值，比色皿不要取出，在2分零5秒時再讀一次透光度值并記錄下T2值。

計算公式：

溶菌酶含量（μg/mL）=（測定管透光度UT₂^[注2]-測定管透光度UT₀^[注1]/標準管透光度ST₂^[注4]-標準管透光度ST₀^[注3]）×標準管濃度×樣本測定前稀釋濃度

[注1]UT0為測定管加應(yīng)用菌液反應(yīng)5秒鐘時的透光度。

[注2]UT2為測定管加應(yīng)用菌液反應(yīng)2分零5秒鐘時的透光度

[注3]ST0為標準管加應(yīng)用菌液反應(yīng)5秒鐘時的透光度

[注4]ST2為標準管加應(yīng)用菌液反應(yīng)2分零5秒時的透光度

1.5 數(shù)據(jù)處理與方差分析

數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進行方差分析和協(xié)方差分析，結(jié)果以平均值表示，當(dāng)P<0.05時認為差異顯著，當(dāng)P>0.05時認為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 兩種蛋白質(zhì)對刺參AOP活性的影響

以發(fā)酵豆粕和酶解魚粉不同比例替代刺參基礎(chǔ)飼料中的大豆粕和魚粉飼養(yǎng)60d后，其各個單元的ACP測定結(jié)果如表5中的ACP的活力。用SPSS16.0軟件對表5中ACP活力進行分析，發(fā)酵豆粕對刺參ACP酶活力的影響極顯著（p<0.01），酶解魚粉對其活力的影響不顯著（p>0.05）。從分析結(jié)果可以看出用發(fā)酵豆粕來替代基礎(chǔ)飼料中的植物蛋白大豆粕蛋白比用酶解魚粉代替基礎(chǔ)飼料中的動物蛋白魚粉對刺參ACP的影響更顯著，兩者之間有顯著差異。

2.1.1 發(fā)酵豆粕對ACP的影響 對發(fā)酵豆粕這個因素用SPSS16.0軟件對表5中的ACP值進行方差分析，由圖1可知發(fā)酵豆粕替代大豆粕各組在60d后ACP活性比不替代組都有所增強。其中100%替代豆粕組ACP活性的增強效果極顯著（p<0.01），其它各組雖有增強但效果不顯著（p>0.05）。

2.1.2 酶解魚粉對ACP的影響 對酶解魚粉這個因素用SPSS16.0軟件對表5中的ACP值進行協(xié)方差分析，由圖2可知酶解魚粉替代魚粉各組在60d后ACP活力都比不替代組有所增強。其中50%替代魚粉組ACP活力的增強效果顯著（p<0.05），其它各組雖有增強但效果不顯著（p>0.05）。

2.2 兩種蛋白質(zhì)對刺參AKP活性的影響

以發(fā)酵豆粕和酶解魚粉不同比例替代刺參幼苗基礎(chǔ)飼料中的大豆粕和魚粉飼養(yǎng)60d后，其各個單元的AKP測定結(jié)果如表5中的AKP的活力。用SPSS16.0軟件對表5中AKP活力進行分析，發(fā)酵豆粕對刺參AKP酶活力的影響顯著（p>0.05），酶解魚粉對其AKP酶活力的影響不顯著（p>0.05）。

2.2.1 發(fā)酵豆粕對AKP的影響 對發(fā)酵豆粕這個因素用SPSS16.0軟件對對表5中的AKP值進行協(xié)方差分析，由圖3可知發(fā)酵豆粕替代豆粕各組在60d后，除50%替代組外，AKP活性都比不替代組有所增強。其中100%替代豆粕組AKP活性的增強效果顯著（p<0.05），其它各組雖有增強但效果不顯著（p>0.05）。

2.2.2 酶解魚粉對AKP的影響 對酶解魚粉這個因素用SPSS16.0軟件對對表5中的AKP值進行協(xié)方差分析，由圖4可知酶解魚粉替代魚粉各組在60d后AKP活性都比不替代組有所增強。其中50%替代魚粉組AKP活性的增強效果顯著（p<0.05），其它各組雖有增強但效果不顯著（p>0.05）

2.3 兩種蛋白質(zhì)對刺參LSZ活性的影響

以發(fā)酵豆粕和酶解魚粉不同比例替代刺參基礎(chǔ)飼料中的大豆粕和魚粉飼養(yǎng)60d后，其各個單元的LSZ測定結(jié)果如表5。用SPSS16.0軟件對表5中LSZ活力進行分析，發(fā)酵豆粕和酶解魚粉對刺參LSZ活力的影響都不顯著（p>0.05）

2.3.1 發(fā)酵豆粕對LSZ的影響 對發(fā)酵豆粕這個因素用SPSS16.0軟件對對表5中的LSZ值進行協(xié)方差分析，由圖5可知發(fā)酵豆粕替代大豆粕各組在60d后，LSZ活性都比不替代組有所增強，其中75%替代組效果顯著（p<0.05）其它各組雖都有增強但效果不顯著（p>0.05）。

2.3.2 酶解魚粉對LSZ的影響 對酶解魚粉這個因素用SPSS16.0軟件對表5中的LSZ值進行協(xié)方差分析，由圖6可知酶解魚粉代魚粉各組在60d后，LSZ活性都比不替代組有所增強，各替代組雖都有增強但效果不顯著（p>0.05）

2.4 兩種蛋白質(zhì)對刺參SOD活性的影響

以發(fā)酵豆粕和酶解魚粉不同比例替代刺參基礎(chǔ)飼料中的大豆粕和魚粉飼養(yǎng)60d后，其各個單元的SOD測定結(jié)果如表5中的SOD的活力。用SPSS16.0軟件對表5中SOD活力進行分析，發(fā)酵豆粕對刺參SOD酶活力的影響不顯著（p>0.05），酶解魚粉對其SOD酶活力影響也不顯著（p>0.05）

2.4.1 發(fā)酵豆粕對SOD的影響 對發(fā)酵豆粕這個因素用SPSS16.0軟件對表5的SOD值進行協(xié)方差分析，由圖7可知發(fā)酵豆粕替代豆粕各組在60d后，除50%替代組外，各替代組SOD活性都比不替代組有所增強，各組雖都有增強但效果不顯著（p>0.05）。

2.4.2 酶解魚粉對SOD的影響 對酶解魚粉這個因素用SPSS16.0軟件對表5中的SOD值進行協(xié)方差分析，由圖8可知酶解魚粉替代魚粉各組在60d后，SOD活性都比不替代組有所增強，各組雖都有增強但效果不顯著（p>0.05）。

3 討論

3.1 關(guān)于免疫酶的作用

ACP是巨噬細胞溶酶體的標志酶，也是巨噬細胞內(nèi)最有代表性的水解酶之一。吞噬是巨噬細胞的典型功能之一，巨噬細胞吞噬異物顆粒形成吞噬體，然后用包括ACP在內(nèi)的溶解酶消化異物顆粒。用ACP的活性表示吞噬細胞清除異物的能力。結(jié)果表明，用發(fā)酵豆粕和酶解魚粉分別替代刺參幼參飼料中的豆粕和魚粉都能提高ACP的活性。兩者從整體上比較用發(fā)酵豆粕代替豆粕的效果要比用酶解魚粉代替魚粉明顯。單獨分析各不同替代組，效果最好的為用發(fā)酵豆粕100%替代豆粕組和用酶解魚粉替代75%魚粉組。這與Meng等認為ACP可以被外源刺激物激活的結(jié)論相吻合。劉樹青等用海藻多糖刺激中國對蝦（Penaeus chinensis）也得到了相似的結(jié)論，即海藻多糖可顯著提高ACP活性；牟海津等研究證實櫛孔扇貝（Chlamys irregularis）經(jīng)口服海藻多糖免疫增強劑后，血清中的ACP活性顯著升高；這與本實驗的結(jié)果相似，說明發(fā)酵豆粕和酶解魚粉對ACP活性的增強與免疫多糖有類似的作用。

AKP普遍存在于動植物體內(nèi)，是一種對底物專一性要求較低的磷酸單脂水解酶，是重要的解毒系統(tǒng)，在堿性條件下，可使磷酸單脂水解生成乙醇和磷酸，并與一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)。本研究結(jié)果表明，用發(fā)酵豆粕和酶解魚粉分別替代刺參幼參飼料中的豆粕和魚粉都能提高AKP的活性。兩者從總體上相比較用發(fā)酵豆粕代替豆粕的效果要比用酶解魚粉代替魚粉明顯。不同替代組中效果最好的為用發(fā)酵豆粕100%替代豆粕組和用酶解魚粉替代75%魚粉組。

LSZ是吞噬細胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，是一種堿性蛋白，可通過水解革蘭氏陽性細菌細胞壁中的乙酰氨基多糖破壞和消除侵入體內(nèi)的異物，從而擔(dān)負起機體防御的功能。本研究結(jié)果表明，用發(fā)酵豆粕和酶解魚粉分別替代刺參幼參飼料中的豆粕和魚粉都能提高LSZ的活性。兩者從整體上比較用發(fā)酵豆粕代替豆粕的效果與用酶解魚粉代替魚粉對LSZ的影響沒有明顯差異。發(fā)酵豆粕不同替代組中效果最好的為用發(fā)酵豆粕75%替代豆粕組（p<0.05），效果顯著。酶解魚粉不同替代組較不替代組都有不同程度的提高，但是經(jīng)SPSS16.0分析效果不顯著（p>0.05）。

SOD是一種重要的抗氧化酶，作為活性氧清除劑參與清除體內(nèi)自由基，可以加速從O^2-轉(zhuǎn)變成H₂O₂和O₂的反應(yīng)，在防機體衰老及防生物分子損傷等方面具有極為重要的作用。有研究報道，SOD活性與生物的免疫水平密切相關(guān)，對于增強吞噬細胞的防御能力和整個機體的免疫功能有重要的作用。本研究結(jié)果表明，兩者從整體上比較用發(fā)酵豆粕代替豆粕的效果與用酶解魚粉代替魚粉對SOD的影響沒有明顯差異。除50%替代組外，發(fā)酵豆粕各個替代組較不替代組SOD活性有所提高，但效果不顯著（p>0.05）。酶解魚粉各個替代組較不替代組SOD活性也都有所提高，但效果也不顯著（p>0.05）。

3.2 發(fā)酵豆粕對免疫力的影響

以上結(jié)果顯示發(fā)酵豆粕和酶解魚粉對刺參免疫酶都有一定的促進作用，其作用效果與其它免疫增強劑有相近的效果。很多學(xué)者研究表明發(fā)酵豆粕對養(yǎng)殖動物的免疫力有增強作用，如陳萱等在商品配合飼料中額外添加發(fā)酵豆粕，飼養(yǎng)異育銀鯽成魚30d，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵豆粕比例的增加，魚體增重率呈上升趨勢，血清溶菌酶活性、白細胞吞噬百分比和血清總蛋白上升，而谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性則下降，與未經(jīng)過發(fā)酵的豆粕相比，發(fā)酵豆粕具有一定的促進生長、增強非特異性免疫功能和改善肝功能的作用。Juana Frias也在研究發(fā)酵豆粕的氨基酸和免疫增強物質(zhì)時認為，發(fā)酵豆粕對動物的免疫力有一定的增強作用，有免疫增強劑的作用。嵇美華，吳定，姚明蘭在研究中都認為發(fā)酵豆粕中的異黃酮有抑制有害細菌和抗氧化的作用。楊耐德等認為營養(yǎng)因子被有效降解，而具有生物活性的小肽能顯著提高動物血液中的胰島素水平，促進淋巴細胞增生，進而提高動物免疫水平。

以上這些學(xué)者的實驗結(jié)果都說明發(fā)酵豆粕在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有益物質(zhì)對動物的免疫力有增強作用，比較發(fā)酵豆粕與大豆粕之間的差別可以看到發(fā)酵豆粕與豆粕相比較不僅去除了豆粕中的各種抗營養(yǎng)因子，降低對水產(chǎn)動物腸道的刺激，而其經(jīng)過發(fā)酵的過程蛋白質(zhì)發(fā)生很大程度上的分解，小分子蛋白含量的上升產(chǎn)生了多種小肽。除此以外還含有一些抑制有害細菌的物質(zhì)（如異黃酮）。這也說明了用發(fā)酵豆粕替代豆粕為什么能提高刺參幼參的免疫力。在另外的實驗中，證明發(fā)酵豆粕能有效促進刺參的生長。這也應(yīng)該是其對刺參免疫力增強的一個間接原因。

3.3 酶解魚粉對免疫力的影響

Anthony L.Murray在研究酶解魚粉對大西洋鮭非特異性免疫功能的影響時認為，在用添加酶解魚粉的飼料飼養(yǎng)鮭魚六周后，添加組與對照組之間非特異性免疫上差異不明顯。這與本實驗的結(jié)果相似。Cahu等在微顆粒飼料中使用魚肉水解蛋白替代魚粉蛋白，舌齒鱸稚魚研究用魚肉水解蛋白替代飼料中的魚粉沒有提高舌齒鱸稚魚的存活率，50%替代組中舌齒鱸稚魚的存活率反而下降。這說明適量的酶解魚粉對水產(chǎn)動物的免疫力有增強作用而添加量過多對免疫能力有一定的抑制作用。Jairo Du-arte在研究酶解魚粉作為添加劑的免疫調(diào)節(jié)作用時認為，酶解魚粉中的小分子多肽對動物的免疫力有調(diào)節(jié)作用。以上學(xué)者的研究都說明酶解魚粉對水產(chǎn)動物自身免疫力有一定的增強作用，本實驗中酶解魚粉對刺參幼參的免疫力也有一定的增強作用，但沒有顯著的效果。

筆者認為在添加發(fā)酵豆粕和酶解魚粉后對刺參幼苗一些免疫酶活力提高沒有明顯效果的原因是，這兩種蛋白主要是提高了高質(zhì)量的蛋白源使其生長加快，而對免疫力的提高是因為刺參身體重量增加間接地使其抵抗力提高。這可能與其它因素有關(guān)，如動物品種、飼養(yǎng)環(huán)境、管理水平、應(yīng)激程度以及取樣部位有關(guān)。因此酶解魚粉對刺參免疫力的影響還有待于進一步研究。

從以上分析可以看出發(fā)酵豆粕和酶解魚粉與豆粕和魚粉相比較更能增強刺參幼參自身的免疫能力，有著與多糖免疫增強劑類似的效果，可以更好地避免大規(guī)模養(yǎng)殖過程中疾病的發(fā)生。其作用機理還有待進一步研究。

（收稿日期：2016-03-09；修回日期：2016-03-14）