王狄　張嘉楠

摘要：建立了使用Waters UPLC Xevo TQ超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)水產(chǎn)品中4種硝基呋喃代謝物的分析方法。勻漿后的樣品在酸性環(huán)境下水解，并用2一硝基苯甲醛衍生16h，經(jīng)磷酸氫二鉀提取，LMS固相萃取小柱凈化后，在三重四極桿多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行測(cè)定。方法采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，四種代謝物的檢出限（LOD）均低于0.25μg·kg^-1，線性范圍在0.5μg·L^-1到10μg·L^-1間，相關(guān)系數(shù)大干0.99。在0.5、1.0和5μg·kg^-1濃度下分別進(jìn)行添加回收試驗(yàn)（n=5），回收率在75.2%～123.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于9.4%。

關(guān)鍵詞：硝基呋喃代謝物；固相萃?。怀咝б合嗌V串聯(lián)質(zhì)譜法；水產(chǎn)品

硝基呋喃類藥物（nitrofurans）主要是指呋喃唑酮（furazolidone，AOZ）、呋喃它酮（furMta-done，AMOZ）、呋喃西林（nitrofurazone，SEM）、呋喃妥因（nitrofurantoin，AHD）等引入硝基的人工合成抗菌藥，近年來發(fā)現(xiàn)其具有慢性毒性，可引起消化道反應(yīng)，美國(guó)、歐盟等工業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)已禁止使用。硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)數(shù)小時(shí)內(nèi)可降解，但其代謝產(chǎn)物能與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的殘留物，殘留時(shí)間達(dá)數(shù)周之久，甚至在蒸煮、烘烤、磨碎和微波加熱過程中也無法有效降解，因此檢測(cè)硝基呋喃類藥物的代謝產(chǎn)物，更能起到監(jiān)控作用。目前歐盟對(duì)硝基呋喃類代謝物的檢測(cè)方法靈敏度規(guī)定為1μg/kg。

試驗(yàn)采用了超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)硝基呋喃類藥物代謝物。在農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-4-2006的基礎(chǔ)上對(duì)樣品前處理過程進(jìn)行了簡(jiǎn)化，并且采用固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行凈化，提高了工作效率和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。經(jīng)過多次試驗(yàn)證明方法的結(jié)果及穩(wěn)定性可靠，適用于日常水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物的痕量檢測(cè)工作。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPLC Xevo TQ液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)沃特世）；雙功能氣浴恒溫振蕩器（江蘇天由有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；氮空氣吹掃濃縮儀（北京斯珀特科技有限公司）；CGX一274ASPEC四通道自動(dòng)固相萃取儀（法國(guó)吉爾森）。

甲醇、乙腈、甲酸和正己烷均為色譜純；鹽酸為優(yōu)級(jí)純；磷酸氫二鉀為分析純；2-硝基苯甲醛（購(gòu)自德國(guó)CNW公司）；所有標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo)均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer；Bond Elut LMS固相萃取小柱（200mg，3mL）。

1.2 樣品前處理

衍生化：稱取（2±0.05）g樣品于離心管中，加入100μg·L^-1的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL，再加入0.1mol·L^-1鄰硝基苯甲醛100μL、0.2mol·L^-1的鹽酸5mL，漩渦混合30s后，于37℃恒溫箱中避光衍生16h。

提?。捍龢悠防鋮s至室溫后，加入1mol·L^-1磷酸氫二鉀5mL，漩渦混勻，用1mol·L^-1氫氧化鈉調(diào)pH值至7.2～7.4后，8000r/min離心10min。

凈化：將5mL樣品上清液加入到BondElutLMS固相萃取小柱中（使用前依次用3mL乙酸乙酯、甲醇和水活化），然后用3mL水淋洗、吹干，最后用3mL乙酸乙酯洗脫。洗脫液于40℃氮?dú)饬飨麓蹈?，殘?jiān)?mL0.1%甲酸水溶解，過0.22μm微孔濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.3 儀器條件

液相色譜條件：

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×100 mm；進(jìn)樣量：5μL；流動(dòng)相：A：0.1%甲酸水B：乙腈；流速：0.3mL/min；柱溫：30℃

質(zhì)譜條件：

離子源：ESI；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；脫溶劑氣流量：650L/h；錐孔氣流量：50L/h；脫溶劑氣溫度：350℃；毛細(xì)管電壓：3kV；離子源：150℃；碰撞氣流量：0.18mL/min；正離子模式；其它參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

試驗(yàn)在農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-4-2006前處理方法的基礎(chǔ)上加入了固相萃取凈化過程。由于乙酸乙酯較水極性小，所以在固相萃取過程中，極性較小的乙酸乙酯作為溶劑會(huì)一定程度上破壞非極性藥物和非極性吸附劑之間的非極性作用力。因此，在提取過程中簡(jiǎn)化掉了藥物從水溶液到乙酸乙酯的轉(zhuǎn)移過程，同時(shí)降低了藥物在轉(zhuǎn)移過程中的損失，提高了回收率。

2.2 固相萃取小柱的選擇

BondElut LMS：是聚合物吸附劑，萃取機(jī)制為非極性，萃取化合物為非極性化合物，在洗脫樣品時(shí)無須再添加有機(jī)胺類改性劑、緩沖液或者酸等。次級(jí)相互作用的消除意味著使用純的有機(jī)溶劑或與HPLC流動(dòng)相兼容的低離子強(qiáng)度的洗脫液即可洗脫目標(biāo)分析物。這種特性可以很好地保證萃取技術(shù)與LC/MS和其它高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)的兼容性。優(yōu)選的吸附劑顆粒大小和大的比表面積保證了萃取效率，可以實(shí)現(xiàn)無干擾萃取。實(shí)驗(yàn)參考了Alexander Leitner，Peter Zollner，Wolfgang LindnerE<對(duì)樣品的固相萃取凈化方法，并選擇了與其方法所用的固相萃取小柱填料相同的安捷倫Bond Elut LMS固相萃取小柱（200mg，3mL）。通過吉爾森四通道自動(dòng)固相萃取儀對(duì)不同添加水平的樣品進(jìn)行固相萃取測(cè)定試驗(yàn)，以及相同添加濃度的樣品分別進(jìn)行固相萃取和無固相萃取過程的對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明，BondElutLMS固相萃取小柱能夠有效地去除樣品基質(zhì)中蛋白類基質(zhì)的干擾，并且能夠保證高的回收率和結(jié)果重現(xiàn)性。

2.3 方法的線性關(guān)系、精密度及準(zhǔn)確度

按照實(shí)驗(yàn)的條件和方法，配置濃度分別為0.5、1、2、5、10μg·L^-1一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，用定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比和標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和內(nèi)標(biāo)濃度比做校正曲線，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及最低檢出限見表3。通過空白基質(zhì)加標(biāo)，并按照S/N=3計(jì)算方法檢出限。結(jié)果表明，4種硝基呋喃代謝物的檢出限為0.05-0.2μg·kg^-1。

2.4 加標(biāo)回收及精密度實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選用大菱鲆、草魚、對(duì)蝦為基質(zhì)，分別采用0.5、1.0和5μg·kg^-1三個(gè)加標(biāo)水平，計(jì)算平均回收率和精密度（n=5），結(jié)果見表4?；Ч?，能夠?qū)λa(chǎn)品中的硝基呋喃代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析。

（收稿日期：2016-05-16；～回日期：2016-05-23）