陳煒璇，韓正洲，仰鐵錘，馬慶，詹若挺，談英*，陳蔚文*，張奉學(xué)

(1.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心 嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東 廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510405)

崗梅根、莖體外抗呼吸道病毒的作用比較研究△

陳煒璇1，2，韓正洲1，2，仰鐵錘1，馬慶1，詹若挺2，談英1*，陳蔚文2*，張奉學(xué)3

(1.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心 嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東 廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510405)

目的：觀察比較崗梅根和崗梅莖水提物對多種呼吸道病毒的抑制作用，為崗梅藥材擴大藥用部位提供參考。方法：分別接種甲1型流感病毒FM1株、呼吸道合胞病毒、鼻病毒R14型、腺病毒3型和副流感病毒3型于MDCK、A549、HEL和LLC-MK2細(xì)胞，采用雞紅血球凝集法觀察崗梅根、莖水提物對甲1型流感病毒FM1株的抑制作用，采用細(xì)胞病變抑制法(CPE)觀察崗梅根、莖水提物對呼吸道合胞病毒、鼻病毒R14型、腺病毒3型和副流感病毒3型的抑制作用。結(jié)果：在無毒濃度下，崗梅根水提物能抑制甲1型流感病毒FM1株、腺病毒3型、合胞病毒RSV和副流感3型病毒，而崗梅莖水提物僅能抑制腺病毒3型及呼吸道合胞病毒RSV。結(jié)論：崗梅根、莖水提物均有一定的體外抗呼吸道病毒作用，崗梅根水提物體外對呼吸道病毒的抑制作用略優(yōu)于崗梅莖。

崗梅根；崗梅莖；體外抗病毒；呼吸道病毒

崗梅為南方常用中草藥，臨床應(yīng)用廣泛，也是多種中成藥和涼茶飲料的重要原料，臨床多用于感冒發(fā)熱、肺熱咳嗽，熱病津傷口渴，咽喉腫痛等病癥[1]。據(jù)研究報道，崗梅提取物具有抗病毒和抗菌等多種藥理活性[2-4]。

崗梅來源于冬青科植物梅葉冬青Ilexasprella(Hook.et Arn.)Champ.ex Benth.[5]，《中華人民共和國藥典》2010版在附錄部分規(guī)定崗梅的藥用部位為“根”[6]，而《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(第一冊)和《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2009年版)則收載崗梅的藥用部位為“根和莖”[1，7]。目前市場上崗梅藥材存在根、莖混用等現(xiàn)象，隨著市場需求的日益增長，崗梅野生資源不斷減少，若能以崗梅莖代替?zhèn)鹘y(tǒng)的崗梅根入藥，將有利于擴大崗梅的藥材來源，從而更好地保護藥材資源。

本研究將通過實驗比較崗梅根和莖水提物體外抗呼吸道病毒的作用效果，評價崗梅莖入藥的合理性，從藥效作用的角度為崗梅藥材擴大藥用部位提供科學(xué)參考。

1 材料

1.1 儀器和試劑

不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；YJ-875醫(yī)用凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；Hfsafe-1500A2型生物安全柜(上海力康)；8道移液器(百得)；20～200 μL移液器(賽默飛)。

小牛血清(廣州蕊特生物科技有限公司，批號：090721)；DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)；0.5%的雞血紅細(xì)胞溶液(自制)。

1.2 病毒和細(xì)胞株

甲1型流感病毒FM1株，于狗腎細(xì)胞(MDCK)傳代，TCID50=4.67；呼吸道合胞病毒(RSV)long株，引進自美國ATCC(VR-26)，于人肺癌細(xì)胞(A549)中傳代，TCID50=3.5；鼻病毒R14型，引進自ATCC(VR-284)；腺病毒3型，引進自廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸道疾病研究所，均于人肺二倍體細(xì)胞(HEL)傳代；副流感病毒3型，引進自廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸道疾病研究所，于恒河猴腎細(xì)胞(LLC-MK2)上傳代。

狗腎細(xì)胞(MDCK)，恒河猴腎細(xì)胞(LLC-MK2)，引進自廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸道疾病研究所；人肺癌細(xì)胞(A549)，人肺二倍體細(xì)胞(HEL)，引進自昆明動物研究所。

以上病毒和細(xì)胞株均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所病毒研究室凍存保種。

1.3 受試藥物

1.3.1 崗梅根和崗梅莖水提物 取2013年1月采集于廣東省平遠(yuǎn)縣的野生崗梅根、莖各8 kg，分別以水提取，濃縮后得到相應(yīng)的水提物浸膏，其中每克崗梅莖浸膏相當(dāng)于生藥8.78 g，每克崗梅根水提物相當(dāng)于生藥8.0 g。

分別精密稱取崗梅莖、崗梅根水提物各0.1 mL，稱重后分別為0.094 5 g、0.106 6 g。500 IU雙抗處理過夜后，用DMEM培養(yǎng)基充分溶解。其中崗梅根水提物母液濃度為106.6 mg·mL-1，崗梅莖水提物母液濃度為94.5 mg·mL-1。實驗時分別用培養(yǎng)基稀釋到一定濃度。

1.3.2 陽性對照藥 利巴韋林(原料藥)，購自肇慶星湖藥業(yè)有限公司，批號：20120523。實驗時稱取一定量的利巴韋林后用培養(yǎng)基充分溶解，將其配制成質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的母液。實驗時用培養(yǎng)基稀釋到一定濃度。

2 方法

2.1 抗甲1型流感病毒FM1株實驗

2.1.1 崗梅水提物在MDCK上毒性濃度的測定 濃度為1.0×105個·mL-1的MDCK以0.1mL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至緊密單層后，分別加入崗梅根水提物、莖水提物(50、12.5、3.12、0.78 mg·mL-1)和利巴韋林(2.0、0.5、0.125、0.031 mg·mL-1)，每個濃度4復(fù)孔，置于35 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 d。4 d后終止實驗，以MTT法檢測受試樣品對細(xì)胞的毒性作用[8]。

2.1.2 崗梅水提物在MDCK上對流感病毒抑制作用的測定 濃度為1.0×105個·mL-1的MDCK以0.1 mL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至緊密單層后，棄上清液加入用含2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的各濃度藥物0.1 mL，崗梅根水提物和莖水提物每個濃度接種4個復(fù)孔，同時攻擊100TCID50的病毒懸液0.1 mL，于35 ℃吸附2 h后，棄上清液。重新加入相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d。終止實驗后，以雞紅血球凝集法判斷待測樣品對病毒的抑制作用。實驗過程中同時設(shè)陽性藥物利巴韋林對照、病毒對照和正常細(xì)胞對照[8]。

2.2 抗呼吸道合胞病毒實驗

濃度為1×105個·mL-1的人肺癌細(xì)胞(A549)按0.1 mL/孔接種96孔細(xì)胞板，待細(xì)胞匯合緊密后，先用含2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋受試樣品，每個樣品上4個梯度濃度。每個濃度接種4個細(xì)胞復(fù)孔，其中孔1、孔2觀察崗梅水提物對細(xì)胞的毒性作用；孔3、孔4加藥后同時攻擊100TCID50病毒懸液100 μL。實驗同時設(shè)置正常細(xì)胞對照、陽性藥物利巴韋林對照及病毒對照。在35 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4 d，終止實驗[9]。

2.3 抗鼻病毒R14型和抗腺病毒3型實驗

濃度為1×105個·mL-1人肺二倍體細(xì)胞(HEL)按0.1 mL/孔接種96孔細(xì)胞板，待細(xì)胞匯合緊密后，按照2.2項的方法，觀察崗梅根、莖水提物對鼻病毒R14型和腺病毒3型的抑制作用。

2.4 抗副流感病毒3型實驗

濃度為1×105個·mL-1恒河猴腎細(xì)胞(LLC-MK2)按0.1 mL/孔接種96孔細(xì)胞板，待細(xì)胞匯合緊密后，按照2.2項的方法，觀察崗梅根、莖水提物對副流感病毒3型的抑制作用。

3 結(jié)果

3.1 抗甲1型流感病毒FM1株實驗

3.1.1 崗梅水提物體外對狗腎細(xì)胞(MDCK)的毒性作用 經(jīng)初步檢測，崗梅根水提物在MDCK細(xì)胞上的半數(shù)毒性濃度為23.04 mg·mL-1，相當(dāng)于生藥184.32 mg·mL-1；崗梅莖水提物在MDCK細(xì)胞上的半數(shù)毒性濃度為10.82 mg·mL-1，相當(dāng)于生藥95.00 mg·mL-1。見表1。

3.1.2 崗梅水提物對病毒的抑制作用 在毒性濃度50 mg·mL-1濃度下，崗梅根水提物與崗梅莖水提物均能完全抑制流感病毒的血凝素，其崗梅根水提物在12.5 mg·mL-1濃度(

陽性藥物利巴韋林在2.0～0.125 mg·mL-1濃度下對病毒具有完全抑制作用，而在最小實驗濃度0.031 mg·mL-1下對流感病毒具有50%的抑制作用。見表2。

表1 崗梅水提物體外毒性濃度的測定結(jié)果(MTT，n=4)

表2 崗梅水提物體外對甲1流感病毒的抑制作用(雞紅血球凝集抑制法)

注：+++表示50%～75%雞紅血球發(fā)生凝集，表示病毒存在；++表示25%～50%的雞紅血球發(fā)生凝集，表示病毒存在；+表示小于25%的雞紅血球發(fā)生凝集，表示有一定量的病毒存在；-表示雞紅血球不發(fā)生凝集，表示藥物對病毒有抑制作用。

3.2 崗梅水提物在A549細(xì)胞中對RSV的抑制作用

崗梅根水提物和崗梅莖水提物在最大實驗濃度40 mg·mL-1下對A549細(xì)胞均無明顯的毒性作用。

崗梅根水提物在無毒濃度40 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥320 mg·mL-1)及20 mg·mL-1濃度(相當(dāng)于生藥濃度160 mg·mL-1)均能抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的致細(xì)胞病變，其中40 mg·mL-1能完全抑制，而20 mg·mL-1能抑制90%的病毒。而崗梅莖在無毒濃度下40 mg·mL-1(相當(dāng)于351.2 mg·mL-1)對RSV呼吸道合胞病毒有90%的抑制作用，而在20 mg·mL-1濃度下對呼吸道合胞病毒無抑制作用。陽性藥物利巴韋林在2.0～0.125 mg·mL-1無毒濃度下對RSV均有完全抑制作用，而最小實驗濃度0.031 mg·mL-1濃度下對RSV無抑制作用。見表3。

表3 崗梅水提物體外抗RSV實驗結(jié)果(CPE法)

注：-為細(xì)胞生長正常，無病變出現(xiàn)；±為細(xì)胞病變少于整個單層細(xì)胞的10%；+為細(xì)胞病變約占整個單層細(xì)胞的25%；++為細(xì)胞病變約占整個單層細(xì)胞的50%；+++為細(xì)胞病變約占整個單層細(xì)胞的75%；++++為細(xì)胞病變約占整個單層細(xì)胞的75%以上；下同。

3.3 崗梅水提物在HEL細(xì)胞中對鼻病毒14型的抑制作用

崗梅根水提物最大實驗濃度46.6 mg·mL-1(相當(dāng)于372.8 mg·mL-1)對HEL細(xì)胞無明顯毒性作用；崗梅莖水提物最大實驗濃度55.05 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥483.34 mg·mL-1)對細(xì)胞具有毒性作用，使細(xì)胞完全破碎，在27.52 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥241.63 mg·mL-1)濃度下，對HEL細(xì)胞有20%的毒性作用。

崗梅根水提物和崗梅莖水提物的最大實驗濃度均對鼻病毒14型無明顯的抑制作用，不能抑制病毒致細(xì)胞病變作用，提示崗梅水提物對鼻病毒無效。

陽性藥物利巴韋林在2.0～0.5 mg·mL-1無毒濃度下對鼻病毒14型具有較好的抑制作用，完全能抑制病毒的致細(xì)胞病變作用。見表4。

表4 崗梅水提物體外抗鼻病毒14型實驗結(jié)果(CPE法)

3.4 崗梅水提物在HEL細(xì)胞中對腺病毒3型的抑制作用

崗梅根水提物最大實驗濃度46.6 mg·mL-1(相當(dāng)于372.8 mg·mL-1)對HEL細(xì)胞無明顯毒性作用；崗梅莖水提物最大實驗濃度55.05 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥483.34 mg·mL-1)對細(xì)胞具有毒性作用，使細(xì)胞完全破碎，在27.52 mg·mL-1濃度下對細(xì)胞無明顯毒性。崗梅根水提物在無毒濃度46.6 mg·mL-1和23.3mg·mL-1濃度下能完全抑制病毒，在11.65 mg·mL-1濃度下能抑制90%的病毒；崗梅莖水提物在毒性濃度55.05 mg·mL-1下和無毒濃度27.52 mg·mL-1下均能完全抑制病毒所致的細(xì)胞病變作用。陽性藥物利巴韋林僅在最大實驗濃度(無毒濃度)2.0 mg·mL-1對腺病毒3型有抑制作用。見表5。

3.5 崗梅水提物在LLC-MK2細(xì)胞中對副流感病毒3型的抑制作用

崗梅根水提物最大實驗濃度50 mg·mL-1(相當(dāng)于400 mg·mL-1)對LLC-MK2細(xì)胞無明顯毒性作用；崗梅莖水提物最大實驗濃度50 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥439 mg·mL-1)對細(xì)胞具有毒性作用，使細(xì)胞完全破碎，在25 mg·mL-1濃度下(相當(dāng)于生藥219.5 mg·mL-1)對細(xì)胞無明顯毒性。崗梅根水提物在無毒濃度50 mg·mL-1能完全抑制副流感病毒3型所致的細(xì)胞病變作用，而崗梅莖在無毒濃度25 mg·mL-1下對副流感3型的致細(xì)胞病變作用無明顯抑制作用。陽性藥物利巴韋林在無毒濃度5.0～1.0 mg·mL-1下均能完全抑制副流感3型病毒，而在0.25 mg·mL-1濃度下對副流感3型無抑制作用。見表6。

表5 崗梅水提物體外抗腺病毒3型實驗結(jié)果(CPE法)

表6 崗梅水提物體外抗副流感病毒3型實驗結(jié)果(CPE法)

4 討論

呼吸道病毒是引起急性上呼吸道感染的主要病原體，其中包括流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等，中藥治療呼吸道疾病歷史悠久，現(xiàn)代研究表明中藥及其成分具有抗病毒的藥理活性[10]。崗梅是南方習(xí)用中草藥，臨床報道應(yīng)用崗梅可有效治療上呼吸道感染，藥理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)崗梅提取物具有抗病毒作用[2，11]。針對崗梅藥材入藥標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、根莖混用和藥材供求關(guān)系日益緊張等情況，通過擴大崗梅藥用部位將有助于解決崗梅的資源問題。因此本研究通過實驗比較崗梅根和莖水提物體外抗呼吸道病毒的作用效果，評價崗梅莖入藥的合理性。

實驗結(jié)果表明，崗梅根與崗梅莖水提物在各種細(xì)胞毒性作用各不相同。其中在恒河猴腎細(xì)胞(LLC-MK2)和人胚肺細(xì)胞(HEL)上，崗梅莖水提物在同濃度下的毒性作用比崗梅根水提物大；而在狗腎細(xì)胞(MDCK)上情況正好相反。在人胚肺癌細(xì)胞(A549)上，崗梅根水提物與崗梅莖水提物最大實驗濃度40 mg·mL-1對細(xì)胞均無明顯毒性作用。

在甲1型流感病毒FM1株中，崗梅根在低毒濃度12.5 mg·mL-1濃度下能完全抑制甲1型流感病毒血凝素，對甲1型流感病毒FM1株有一定的抑制作用。

在合胞病毒實驗中，崗梅莖水提物40 mg·mL-1、崗梅根水提物在20 mg·mL-1對A549細(xì)胞無毒且對呼吸道合胞病毒RSV具有較好的抑制作用。在腺病毒實驗中，崗梅莖水提物在27.52 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥濃度241.63 mg·mL-1)、崗梅根水提物在23.3 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥濃度186.4 mg·mL-1)無毒濃度下對腺病毒3型均具有完全的抑制作用。在鼻病毒實驗中，崗梅莖和崗梅根水提物在無毒濃度下兩者對鼻病毒14型均無作用；在對副流感3型的實驗中，崗梅根在50 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥濃度400 mg·mL-1)無毒濃度下能完全抑制病毒致細(xì)胞病變作用，而崗梅莖對副流感3型無明顯抑制作用。

崗梅根水提物能抑制甲1型流感病毒FM1株、腺病毒3型、合胞病毒RSV和副流感3型病毒，而崗梅莖水提物僅能抑制腺病毒3型及呼吸道合胞病毒RSV。崗梅根水提物體外對呼吸道病毒的抑制作用略優(yōu)于崗梅莖。由于體外實驗只能從一定角度反映藥物的作用，尚需在后續(xù)研究中比較崗梅根、莖水提液的體內(nèi)抗病毒作用。

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ComparativeStudyonEffectofIlexasprellaRootandStemagainstRespiratoryViruses

CHEN Weixuan1，2，HANZhengzhou1，2，YANGTiechui1，MAQing1，ZHANRuoting2，TANYing1*，CHENWeiwen2*，ZHANGFengxue3

(1.ChinaResourcesSanjiuMedical&PharmaceuticalCo.，Ltd.，Shenzhen518110，China；2.ResearchCenterofChineseHerbalResourcesandEngineeringofGuangzhouUniversityofChineseMedicine，KeyLaboratoryofChineseMedicineResourcesofMinistryofEducation，Guangzhou510006，China；3.TropicalMedicineInstitute，GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510405，China)

Objective：To observe and compare the inhibitory effect ofIlexasprellaroot aqueous extract andI.asprellastem aqueous extract on several respiroviruses，in order to provide references for expansion ofI.asprella’smedicinal parts.Methods：MDCK，A549，HEL and LLC-MK2 cell were infected with influenza virus type A FM1 strain，RSV，rhinovirus type 14，adenovirus type 3，parainfluenza virus type 3 separately.The inhibitory effect ofI.asprellaroot aqueous extract andI.asprellastem aqueous extract on influenza virus type A FM1 strain was observed by using chicken hemagglutination method.And CPE was used to observe the inhibitory effect ofI.asprellaroot aqueous extract andI.asprellastem aqueous extract on RSV，rhinovirus type 14，adenovirus type 3，parainfluenza virus type 3.Results：At the nontoxic concentration，I.asprellaroot aqueous extract can inhibit influenza virus type A FM1 strain，RSV and parainfluenza virus type 3，whileI.asprellastem aqueous extract only inhibit adenovirus type 3 and RSV.Conclusion：BothI.asprellaroot aqueous extract andI.asprellastem aqueous extract can inhibit some of respiratory virusesinvitro.The inhibitory effect ofI.asprellaroot aqueous extract on respiratory virusesinvitrois better than that ofI.asprellastem aqueous extract.

Ilexasprellaroot，Ilexasprellastem，anti-respiratoryinvitro，respiratory viruses

2015-04-14)

“十二五”科技重大專項(2012ZX09201-201-001)；廣東省科技計劃項目(2012A030100006)

*

談英，高級工程師，研究方向：創(chuàng)新中藥研究與開發(fā)，E-mail：tanying@999.com.cn； 陳蔚文，教授，研究方向：創(chuàng)新中藥研究與開發(fā)，E-mail：chenww@gzucm.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.006