曾欣宜，朱英杰，李瀅，孫超*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700)

·基礎(chǔ)研究·

基于全基因組的紫芝細(xì)胞色素P450分析△

曾欣宜1，朱英杰2，李瀅1，孫超1*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700)

目的：紫芝是多孔菌科靈芝屬的重要傳統(tǒng)中藥。細(xì)胞色素P450是一類含血紅素的單加氧酶。本研究的目的是對(duì)紫芝基因組編碼的CYP450序列進(jìn)行比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析。方法：發(fā)掘紫芝基因組編碼的所有P450基因，構(gòu)建紫芝CYP450系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，比較靈芝屬3個(gè)已測(cè)序物種中P450基因家族的差異，并對(duì)紫芝中可能參與三萜生物合成的P450基因家族進(jìn)行染色體定位和內(nèi)含子相位分析。結(jié)果：紫芝基因組共編碼228個(gè)CYP450基因，其中包括9個(gè)假基因，在進(jìn)化上分為3個(gè)分支，分布在41個(gè)家族中，其中CYP5359家族最大，包含有53條序列。紫芝所有的P450基因家族在其他兩個(gè)靈芝屬真菌中都存在。CYP512和CYP5144家族可能參與靈芝酸生物合成，其中一些家族成員可能是通過(guò)基因復(fù)制進(jìn)化而來(lái)的。結(jié)論：紫芝P450基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析與進(jìn)化機(jī)制研究為進(jìn)一步揭示紫芝P450基因的功能與生理生化作用奠定了基礎(chǔ)。

紫芝；CYP450；靈芝三萜；進(jìn)化

紫芝Ganodermasinense是名貴傳統(tǒng)中藥材，為擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)多孔菌目(Polyporales)多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬Ganodermae真菌[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明紫芝具有提高免疫力，抗腫瘤[2-3]，調(diào)節(jié)血糖血脂[4-7]，延緩衰老[8]等多種功效。紫芝與赤芝G.lucidum作為中藥?kù)`芝的基原物種，已被收錄于《中華人民共和國(guó)藥典》2010版[9]。

本課題組相繼完成了赤芝和紫芝基因組精細(xì)圖，為研究靈芝有效成分的生物合成及其他生物學(xué)問(wèn)題奠定了基礎(chǔ)[10-11]。靈芝三萜是靈芝的主要活性成分之一，目前已從靈芝中分離得到150多種[12]。靈芝三萜是高度氧化的羊毛甾醇衍生物，推測(cè)有多個(gè)細(xì)胞色素P450單加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenases，P450s)參與了靈芝三萜的生物合成過(guò)程。P450s是一類能夠在溫和的條件下把底物中反應(yīng)惰性的碳?xì)滏I氧化的單加氧酶，是參與次生代謝的重要酶類之一，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞色素P450命名法，目前已鑒定大約19 000種P450s[13]。P450s主要參與的反應(yīng)有：羥基化、環(huán)氧化、脫烷基化、碘化硫化、脫氨基化、脫硫化、脫鹵化和硝基還原作用[14]。本研究對(duì)紫芝編碼的所有P450基因進(jìn)行了分類和進(jìn)化分析，然后與靈芝屬其它兩個(gè)已測(cè)序真菌赤芝和Ganodermasp.中的P450基因進(jìn)行了比較研究，并對(duì)可能參與靈芝酸合成的P450家族進(jìn)行了預(yù)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 序列來(lái)源

赤芝和紫芝細(xì)胞色素P450數(shù)據(jù)來(lái)源于本課題組紫芝基因組。

1.2 分析軟件及處理方法

1.2.1 系統(tǒng)進(jìn)化分析 本文中用到的系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件有：分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA6.06，用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自舉檢驗(yàn)法Bootstrap(1000次)檢驗(yàn)各分支的支持率[15]。

1.2.2 內(nèi)含子相位分析 CYP512基因和CYP5144基因的內(nèi)含子相位圖是利用in-house腳本對(duì)基因結(jié)構(gòu)注釋文件進(jìn)行分析得來(lái)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫芝CYP450分析

紫芝P450有228條序列，9條假P450序列，分布在41個(gè)家族中，其中CYP5359家族最為龐大，有53條序列均歸屬到該家族，其次為39條序列的CYP5150家族和31條序列的CYP512家族(圖1)。其中最長(zhǎng)的3條CYP450蛋白序列分別是：CYP6005B1(1102aa)、CYP6005A1(1024aa)和CYP63A37(614aa)，而最短的條序列僅200多氨基酸：CYP5136D12P(221aa)和CYP5349A3(218aa)。對(duì)紫芝CYP450的系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)可以分成3枝(圖2)，其中最大的一枝共有132個(gè)CYP家族，包括：CYP5150(39)、CYP512(31)、CYP5035(25)、CYP5136(9)、CYP63(7)、CYP537(2)、CYP5140(2)、CYP5364(2)以及僅1條序列的CYP5151、CYP5138、CYP5137、CYP51、CYP5341、CYP5340和CYP5141。擁有88個(gè)CYP家族是第二大枝，這枝有著紫芝CYP家族中數(shù)目最多的CYP5359家族，共53條序列，其他家族數(shù)目均較少，為6條序列的CYP5037，以及4條序列的CYP5144家族和CYP5148家族，兩外還有3條序列的CYP5348家族和2條序列的CYP5058家族，以及僅1條序列的CYP502、CYP5351、CYP5158、CYP5065、CYP5360、CYP5152、CYP5349 、CYP5361、CYP5362、CYP5365、CYP53、CYP61、CYP642、CYP5347、CYP5366和CYP5139。第三枝所含CYP家族最少，共4個(gè)家族，包括7條序列：CYP505(3)、CYP6005(2)、CYP5141(1)和CYP5156(1)。在這枝中，CYP6005B1和CYP6005A1有著紫芝CYP450中最長(zhǎng)的序列。

2.2 靈芝屬真菌P450分類及家族比較

對(duì)基因組水平的靈芝屬真菌P4 50分析發(fā)現(xiàn)(圖1)，靈芝屬的三個(gè)真菌的P450數(shù)目龐大，家族類別較多，雖比植物少，但是在真菌中，是較為豐富的。在這三種靈芝屬真菌中，相較于其他家族，CYP63、CYP512、CYP5035、CYP5037、CYP5136、CYP5139、CYP5144、CYP5150和CYP5359的數(shù)目是較多的，而CYP53、CYP61、CYP502、CYP642、CYP5065、CYP5137、CYP5138、CYP5151、CYP5152、CYP5156、CYP5158、CYP5347、CYP5349、CYP5351、CYP5360、CYP5362、CYP5365和CYP5366這些CYP家族在三種靈芝屬真菌中的數(shù)目均為一。其中紫芝CYP450家族最為龐大，并且紫芝CYP512、CYP5035、CYP5150和CYP5359均明顯多于其他兩個(gè)靈芝屬真菌(圖2)。而在G.sp中，CYP63、CYP5136、CYP5144和CYP5148是較多的。在赤芝中，僅CYP5356是其獨(dú)有的P450家族，而其他家族與另外兩種靈芝屬在數(shù)量上均較為一致，且并不多于其他兩種。

2.3 可能參與紫芝酸生物合成的CYP450分析

研究表明，CYP512和CYP5144在動(dòng)物中對(duì)甾體激素、睪酮等激素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，而在赤芝中CYP512基因與CYP5144基因與羊毛甾醇合酶(LSS)共表達(dá)[11]，因此預(yù)測(cè)這兩個(gè)P450家族可能參與紫芝三萜的生物合成。

圖1 紫芝CYP450家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖2 靈芝屬真菌P450家族分類比較(圖中G.sp數(shù)據(jù)來(lái)源于Khajamohiddin[16])

搜索CYP512和CYP5144基因后，對(duì)其染色體位置圖(圖3A)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)家族的基因分布在2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、10號(hào)、11號(hào)和12號(hào)染色體，而1號(hào)染色體、6號(hào)染色體、8號(hào)染色體和9號(hào)染色體上均沒(méi)有分布。在5號(hào)染色體的0-500kb的位置共分布18個(gè)基因(圖3B)，并且分布位置是臨近的，因此推測(cè)可能存在重復(fù)基因的現(xiàn)象，對(duì)此構(gòu)建了N-J樹(shù)和內(nèi)含子相位圖(圖3C)。分析后可以發(fā)現(xiàn)，GS09913和GS09914可能互為重復(fù)基因，從內(nèi)含子相位圖來(lái)看，極有可能為某段外顯子的“移動(dòng)”所導(dǎo)致的基因重復(fù)，在N-J樹(shù)中這兩個(gè)基因進(jìn)化關(guān)系也十分接近。GS06038和GS06037在2號(hào)染色體上位置接近，內(nèi)含子相位也一致，由此可推測(cè)這兩個(gè)基因可能為重復(fù)基因。同樣地，GS04141和GS04140、GS07489和GS07486、GS03132和GS03141以及GS11489和GS11434也可能是互為重復(fù)基因。

圖3 CYP512基因和CYP5144基因分析

3 討論

紫芝CYP450共有228條P450序列，9條假P450s，分布在41個(gè)家族中，CYP5359家族(53 P450s)數(shù)目最多，其次為CYP5150家族(39 P450s)和CYP512家族(31 P450s)。對(duì)紫芝CYP450的系統(tǒng)進(jìn)化可分為三枝，其中132個(gè)P450聚在數(shù)目最多的一枝，88個(gè)P450聚成的是第二枝，其中包括紫芝中數(shù)目最多的CYP5359家族，第三枝的數(shù)目較少，僅7個(gè)P450，聚在該枝的是紫芝中P450序列最長(zhǎng)的幾條。而對(duì)三種靈芝屬真菌P450比較分析發(fā)現(xiàn)，在真菌中，其P450數(shù)目是比較龐大的，且CYP63、CYP512、CYP5035、CYP5037、CYP5136、CYP5139、CYP5144、CYP5150和CYP5359這些P450家族在三種靈芝中的數(shù)目都是較多的。值得關(guān)注的是，在三種靈芝屬CYP家族分析中，每種靈芝的基因組對(duì)P450家族數(shù)目的偏好是不同的。在紫芝中，CYP512、CYP5035、CYP5150和CYP5359這四個(gè)家族是其所偏好的，家族數(shù)目明顯多于其他兩種靈芝。而在G.sp中，CYP63、CYP5136、CYP5144和CYP5148是其偏好的。與另外兩種靈芝相比，赤芝并沒(méi)有其特有偏好的P450家族。

據(jù)報(bào)道，P450基因常與參與次生代謝的基因組成基因簇，共同調(diào)控靈芝次生代謝。在紫芝中，同樣地，預(yù)測(cè)CYP512家族和CYP5144家族極有可能與LSS(羊毛甾醇合酶)共表達(dá)，參與到紫芝三萜的生物合成中。進(jìn)而對(duì)這兩個(gè)家族的基因進(jìn)行分析，基因分布在染色體的位置圖表明其中有18個(gè)基因分布在5號(hào)染色體上，且位于100～600 Kb的位置。進(jìn)一部分析基因的內(nèi)含子相位和系統(tǒng)進(jìn)化分析后發(fā)現(xiàn)，可能存在多組基因重復(fù)現(xiàn)象，分別為GS09913和GS09914、GS06038和GS06037、GS04141和GS04140、GS07489和GS07486、GS03132和GS03141以及GS11489和GS11434。

靈芝三萜是靈芝中主要的活性成分，它們是由共同的底物環(huán)狀骨架羊毛甾醇生成的，而CYP450是這一類底物的重要修飾酶家族。因此，通過(guò)對(duì)紫芝中CYP450的組成、分類及靈芝屬內(nèi)的比較分析，對(duì)CYP450的功能驗(yàn)證及解析紫芝中三萜類成分的生物合成奠定了基礎(chǔ)。為中藥?kù)`芝資源的保護(hù)及合理開(kāi)發(fā)利用，以及道地藥材的挖掘提供理論指導(dǎo)。

[1] 林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2007.25-198.

[2] Liu J Q，Wang C F，Li Y，et al.Isolation and bioactivity evaluation of terpenoids from the medicinal fungusGanodermasinense[J].PlantaMed，2012，78(4)：368-376.

[3] Yue G G，F(xiàn)ung K P，Tse G M，et al.Comparative studies of various ganoderma species and their different parts with regard to their antitumor and immunomodulating activities in vitro[J].JAlternComplement，2006，12(8)：777-789.

[4] Sato N，Ma C M，Komatsu K，et al.Triterpene-Farnesyl hydroquinone conjugates fromGanodermasinense[J].Nat Prod，2009，72(5)：958-961.

[5] Yue G G，Chan B C，Han X Q，et al.Immunomodulatory Activities ofGanodermasinensePolysaccharides in Human Immune Cells[J].NutrCancer，2013，65(5)：765-774.

[6] Han X Q，Chan B C，Dong C，et al.Isolation,structure characterization，and immunomodulating activity of a hyperbranched polysaccharide from the fruiting bodies ofGanodermasinense[J].JAgricFoodChem，2012，60(17)：4276-4281.

[7] Wu H T，Lu F H，Su Y C，et al.Invivoandinvitroanti-tumor effects of fungal extracts[J].Molecules，2014，19(2)：2546-2556.

[8] Paterson R R M.Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory[J].Phytochemistry，2006，67(18)：1985-2001

[9] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：205.

[10] Chen S L，Xu J，Liu C，et al.Genome sequence of the model medicinal mushroomGanodermalucidum[J].Nat.Commun.，2012(3)：913.

[11] Zhu Y J，Xu J，Sun C，et al.Chromosome-level genome maP provides insights into diverse defense mechanisms in the medicinal fungusGanodermasinense[J].Sci.Rep.，2015(5)：11087.

[12] 李曄，朱忠敏，姚渭溪，等.靈芝三萜類化合物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37(2)：165-171.

[13] Nelson D R.Progress in tracing the evolutionary paths of cytochrome P450[J].ActaBiochim.Biophys.Sin.，2011，1814(1)：14-18.

[14] Sono M，Roach M P，Coulter E D，et al.Hemecontaining oxygenases[J].Chem.Rev.，1996，96(7)：2841-2888.

[15] Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al.MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0.[J]Mol.Biol.Evol.，2013，30(12)：2725-2729.

[16] Khajamohiddin S，David R.，Robert R，et al.Genomewide annotation and comparative genomics of cytochrome P450 monooxygebases (P450s) in the polypore speciesBjerkanderaadusta，Gandermasp.andPhlebiabrevispora[J].Mycologia，2013，105(6)：1445-1455.

ResearchofCytochromeP450inGanodermasinenseBasedonAnalysisofGenomicData

ZENG Xinyi1，ZHUYingjie2，LIYing1，SUNChao1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChinaAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective：Ganodermasinense，belonging to the Polyporales，Ganodermae，is one of the most well-known medicinal mushrooms in the world.Cytochrome P450s are monooxygenases containing heme.Our study aims to understand the evolution of P450 families inG.sinense.Methods：We found all P450 genes from theG.sinensegenome and constructed their phylogenetic tree.The P450s fromG.sinensewere compared with those from the other two sequenced fungi from Ganoderma genus.We also analyzed the chromosome location and intron phases of the P450 genes possibly involved in the biosynthesis of triterpenoids.Results：TheG.sinensegenome encoded a total of 228 P450 genes，including 9 pseudogenes.All of them were divided into three clans and 41 families，among which，CYP5359 is the biggest family containing 53 members.All the P450 families inG.sinensealso exist in the other two sequenced Ganoderma species.CYP512 and CYP5144 families were supposed to be involved in the biosynthesis of triterpenoids and some of their members were generated by gene duplications.Conclusion：We analyzed the phylogenetics of P450s inG.sinenseand explored their possible evolutional mechanism，which will lay the foundation for further study on the function and physiological activities of these P450s.

Ganodermasinense；CYP450；triterpenoid；evolution

2016-04-06)

國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目(81273485)；國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目(81573704)

*

孫超，研究員，研究方向：功能基因組學(xué)；Tel：(010) 57833197，E-mail：csun@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.005