謝 榮，韓俊杰，寶 麗，劉宏偉

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所，西藏 拉薩 850032；2.中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100000)

西藏白肉靈芝自2014 年在拉薩國家農(nóng)業(yè)科技示范園區(qū)馴化栽培成功[1]后，在拉薩市曲水縣聶當(dāng)鄉(xiāng)、才納鄉(xiāng)，林芝市巴宜區(qū)、工布江達(dá)縣巴河鎮(zhèn)、米林縣、波密縣的脫貧攻堅中發(fā)揮了重要作用。三萜作為白肉靈芝的主要藥效成分[2-7]，白肉靈芝相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，需提供品質(zhì)穩(wěn)定的原料，不同生長環(huán)境對其三萜成分有何影響目前尚無研究。因此，本研究采用化學(xué)分光光度法和高效液相色譜(HPLC)，測定和分析了孢子粉、液體發(fā)酵和不同來源的子實體中三萜含量和組分種類。有研究指出，在赤芝生長初期即原基期，噴施一定劑量的水楊酸會刺激子實體中三萜的生成[8，9]，水楊酸是否對白肉靈芝的三萜合成有同樣作用，目前均尚未有報道。本研究為栽培白肉靈芝三萜的開發(fā)利用及質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

供試樣品見表1。

表1 供試樣品列表

1.1 總?cè)坪繙y定方法：

(1)將白肉靈芝子實體放在50 ℃的烘箱，20 h后取出，粉碎，過60目的篩備用。

(2)供試品溶液的制備 取(1)的樣品5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶，加入100 mL 乙醇，回流提取2 h，濾去濾渣，即得供試品溶液。

(3)對照品溶液的制備 取齊墩果酸對照品20.00 mg，加甲醇定容至100 mL，即得0.20 mg/mL的對照品溶液。

(4)顯色方法 靈芝總?cè)坪康臏y定采用冰醋酸-香草醛法。精密量取供試品溶液或?qū)φ掌啡芤褐糜?5 mL 具塞試管中，揮干，放冷，精密加入現(xiàn)配的冰醋酸-香草醛溶液(精密稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得)、0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，在70 ℃水浴中加熱15 min，立即置冰浴中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在546 nm波長處測定吸光度。

(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 按照中國藥典的方法：精密量取對照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，0.6 mL，0.8 mL，分別置15 mL具塞試管中，揮干，放冷，精密加入新配制的香草醛-冰醋酸溶液(精密稱取香草醛0. 5g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得)0.2 mL 高氯酸0.8 mL，搖勻，在70 ℃水浴中加熱15 min，立即置冰浴中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在546 nm 波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程為y=5.4062x-0.0403，相關(guān)系數(shù)R=0.999 5，表明方程擬合度較好。

1.2 HPLC分析方法：

流速：1 mL/min，色譜柱：YMC，C18，250 min×4.6 mm，檢測波長254 nm，高效液相洗脫流程見表2。

表2 高效液相洗脫流程

2 結(jié)果分析

圖1 結(jié)果顯示，在連作2 年的前提下，2019 年栽培的白肉靈芝三萜質(zhì)量比下降明顯，2020 年栽培的白肉靈芝三萜質(zhì)量比又有所恢復(fù)，為16.8 mg/g。

圖1 2017—2020年連作栽培三萜含量變化

根據(jù)三萜來源和結(jié)構(gòu)差異將液相圖譜三萜組分劃分為：混源萜類化合物、白肉靈芝特有靈芝三萜、傳統(tǒng)靈芝三萜、三萜法尼基復(fù)合物類，其中傳統(tǒng)靈芝三萜即為赤芝常見的種類。表3和圖2結(jié)果顯示，孢子粉中三萜含量較低，只有極少量的混源萜類化合物、傳統(tǒng)靈芝三萜及三萜法尼基，基本不含白肉特有靈芝三萜，豐富程度低。

表3 供試樣品三萜含量

續(xù)表

續(xù)表

圖2 孢子粉三萜組分

圖3 結(jié)果顯示，發(fā)酵菌絲體中含有少量的傳統(tǒng)靈芝三萜及三萜法尼基復(fù)合物化合物，而發(fā)酵液乙酸乙酯萃取后旋蒸部分中幾乎不含三萜化合物。

圖3 液體發(fā)酵培養(yǎng)三萜組分

圖4 結(jié)果顯示，乃東和波密的混源萜類化合物、白肉特有靈芝三萜、傳統(tǒng)靈芝三萜及三萜法尼基的化合物成分組成基本沒有差異，巴河的三萜化合物豐富度高于乃東和巴河。

圖4 不同栽培地三萜組分差異

表3、圖1 和圖5 結(jié)果顯示，在連作兩年前提下，2019 年栽培的白肉靈芝三萜質(zhì)量比下降明顯，2020 年栽培的白肉靈芝三萜質(zhì)量比又有所恢復(fù)，為16.8 mg/g。

圖6 結(jié)果顯示，白肉特有靈芝三萜和傳統(tǒng)靈芝三萜化合物在林芝1-5 號中相對含量較高，林芝2號、5號三萜含量較高與液相圖譜結(jié)構(gòu)一致。

圖7 結(jié)果顯示，同一栽培地，不同顏色子實體白肉靈芝特有靈芝三萜、傳統(tǒng)靈芝三萜及三萜法尼基復(fù)合物的含量在中基本沒有差異。

圖8 和圖9 結(jié)果表明，水楊酸蕾期噴施濃度100 μmol/L時三萜質(zhì)量比增加顯著。

圖9 2020年水楊酸蕾期噴施誘導(dǎo)試驗

圖10結(jié)果表明，5號棚中白肉特有靈芝三萜和傳統(tǒng)靈芝三萜化合物相對含量較高，其中5 號棚水楊酸100 三萜質(zhì)量比最高，水楊酸混合部分三萜質(zhì)量比略低。

圖10 5號棚水楊酸誘導(dǎo)試驗三萜組分差異

圖11 結(jié)果表明，靈芝CK，100，200，400，800，1600 樣品間成份差異不大，其中傳統(tǒng)靈芝三萜相對質(zhì)量比最豐富，靈芝100總?cè)瀑|(zhì)量比略高。

圖11 2020年水楊酸誘導(dǎo)試驗三萜組分差異

3 結(jié) 論

孢子粉、液體發(fā)酵培養(yǎng)均不如子實體栽培三萜含量高，組分豐富；同一產(chǎn)地連作三萜含量有下降趨勢，與不同產(chǎn)地、不同來源栽培種同一地栽培比較，在組分上豐富度也明顯下降，尤其是白肉靈芝特征三萜幾乎沒有。濃度為100 μmol/L 的水楊酸蕾期誘導(dǎo)噴施試驗總?cè)坪柯愿?，組分差異不大，其中傳統(tǒng)靈芝三萜相對含量最豐富，說明水楊酸誘導(dǎo)三萜生物合成有一定作用，只能刺激部分白肉靈芝特有三萜組分形成。