周維，胡昌江，戴德榮，張秀環(huán)，馮健

(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，四川 彭州 611930 )

丹參飲片、標(biāo)準(zhǔn)水煎劑、配方顆粒HPLC特征圖譜相關(guān)性研究

周維，胡昌江*，戴德榮，張秀環(huán)，馮健

(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，四川 彭州611930)

目的：采用高效液相色譜法對(duì)丹參飲片、標(biāo)準(zhǔn)水煎劑、配方顆粒的特征圖譜進(jìn)行相關(guān)性研究，考察不同的存在形式對(duì)丹參化學(xué)成分的影響。方法：采用菲羅門luna5uC18柱(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，以乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為286nm；流速為10mL·min-1；進(jìn)樣量為10μL。分別建立10批丹參飲片、10批丹參標(biāo)準(zhǔn)水煎劑、10批丹參配方顆粒的特征圖譜。結(jié)果：丹參配方顆粒HPLC特征圖譜的7個(gè)特征峰均可在飲片、標(biāo)準(zhǔn)水煎劑中得到追蹤，并從7個(gè)共有峰中指認(rèn)出迷迭香酸、丹酚酸B、丹參素鈉、原兒茶醛4個(gè)成分。結(jié)論：丹參飲片、標(biāo)準(zhǔn)水煎劑、配方顆粒的主要化學(xué)成分組成基本相同。

丹參飲片；丹參標(biāo)準(zhǔn)水煎劑；丹參配方顆粒；特征圖譜

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功能[1]，其中脂溶性成分為丹參酮類，水溶性成分為丹酚酸類[2]。丹參配方顆粒為丹參飲片經(jīng)現(xiàn)代技術(shù)提取、濃縮、干燥、制粒等工藝制備而成，已經(jīng)失去了飲片的外觀形態(tài)、顯微特性，難以直觀鑒別。如果僅用某成分的含量限度作為質(zhì)量控制指標(biāo)，則較難全面地判定配方顆粒的真?zhèn)闻c優(yōu)劣。因此，需要制定出專屬性更強(qiáng)、重復(fù)性更強(qiáng)、有效可控的方法來控制丹參配方顆粒的質(zhì)量。特征圖譜的研究能很好地給丹參配方顆粒的定性鑒別提供準(zhǔn)確的依據(jù)，能夠在化學(xué)成分的層面上進(jìn)行全面的鑒別[3]。丹參配方顆粒做為丹參顆粒性飲片，應(yīng)與丹參飲片及其水煎液具有相同的化學(xué)成分，這三者的相關(guān)性目前尚未見報(bào)道。本研究采用HPLC法建立了丹參飲片、丹參標(biāo)準(zhǔn)水煎劑、丹參配方顆粒的特征圖譜，比較了三者化學(xué)成分的差異。

1 儀器與試藥

1.1儀器

安捷倫1200型高效液相色譜儀；電子天平BP211D(Sautoris，德國)；超聲波清洗器(昆山市儀器有限公司，KQ5200DB型)。

1.2試藥

丹酚酸B、迷迭香酸(中國是食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為1152-200605，111871-201102)；丹參素鈉(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110855-201210，含量91.2%)；原兒茶醛(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110810-200506)；甲醇為色譜純；水為純凈水；磷酸(HPLC級(jí))。

10批不同來源的丹參飲片產(chǎn)地為山東，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)胡昌江教授鑒定為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖；10批丹參標(biāo)準(zhǔn)水煎劑按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》中煎藥操作方法進(jìn)行制備；10批丹參配方顆粒(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，批號(hào)分別為1312085，1312086，1312087，1304044，1405321，1404231，1411124，1501325，1504155，1507214)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

菲羅門LunaC18(2)(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為286nm；柱溫為25℃；流速為1.0mL·min-1[4-6]。

表1 梯度洗脫程序

2.2供試品溶液的制備

2.2.1丹參飲片溶液的制備 取丹參飲片50g，加水適量，煎煮1h，濾過，濾液用水定容至1000mL，即得。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)煎劑的制備 取丹參飲片50g，第一次加8倍水，浸泡30min，煎煮30min，濾過；第二次加6倍水，煎煮30min，濾過，合并水煎液，用水定容至1000mL，即得。

2.2.3丹參配方顆粒供試品的制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水25mL，稱定重量，超聲處理(功率為250W，頻率為33kHz)30min，取出，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗(yàn) 按照2.2.3項(xiàng)下方法制備丹參配方顆粒供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，結(jié)果7個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0～0.2%，相對(duì)峰面積的RSD為0～0.55%，表明儀器的精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照2.2.3項(xiàng)下方法制備丹參配方顆粒供試品溶液，分別于0、4、8、12、24h測(cè)定，結(jié)果7個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0～0.53%，相對(duì)峰面積的RSD為0～0.46%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn) 按照2.2.3項(xiàng)下方法制備6份丹參配方顆粒供試品溶液，按照擬定方法測(cè)定，結(jié)果7個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0～0.2%，相對(duì)峰面積的RSD為0～0.83%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4樣品的測(cè)定

精密取10批丹參飲片供試品溶液、標(biāo)準(zhǔn)水煎劑、丹參配方顆粒供試品溶液各10μL，按擬定方法測(cè)定。

2.5特征圖譜的建立

2.5.1參照峰的選擇與共有特征峰的確定 采用擬定的方法分別對(duì)10批丹參飲片、10批丹參標(biāo)準(zhǔn)水煎劑、10批丹參配方顆粒進(jìn)行特征圖譜的測(cè)定，并建立了HPLC特征圖譜，見圖1～4。根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定及各批次樣品均能檢出，且峰相對(duì)較高的原則，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)進(jìn)行Mark峰匹配。共選擇了7個(gè)重復(fù)性較好的峰作為共有特征峰。通過與對(duì)照品色譜圖比較可得，7個(gè)共有特征峰當(dāng)中，峰1為丹參素鈉，峰2為原兒茶醛，峰5為迷迭香酸，峰6為丹酚酸B。結(jié)果見圖5。同時(shí)選擇峰6(丹酚酸B)為參照峰。

注：S1～S10為10批丹參飲片樣品；R為對(duì)照?qǐng)D譜。圖1 10批丹參飲片HPLC特征圖譜

注：S1～S10為10批丹參標(biāo)準(zhǔn)水煎劑樣品；R為對(duì)照?qǐng)D譜。圖2 10批丹參標(biāo)準(zhǔn)水煎液HPLC特征圖譜

注：S1～S10為10批丹參配方顆粒樣品；R為對(duì)照?qǐng)D譜。圖3 10批丹參配方顆粒HPLC特征圖譜

注：A.丹參配方顆粒；B.丹參標(biāo)準(zhǔn)水煎劑；C.丹參飲片。圖4 丹參飲片、標(biāo)準(zhǔn)水煎劑、配方顆粒HPLC特征圖譜比較

注：A.丹參飲片供試品溶液；B.對(duì)照品溶液；1.丹參素鈉；2.原兒茶醛；5.迷迭香酸；6.丹酚酸B。圖5 色譜峰的指認(rèn)

2.5.2丹參飲片、標(biāo)準(zhǔn)水煎劑、配方顆粒相關(guān)性研究 由圖4可得，丹參配方顆粒和標(biāo)準(zhǔn)煎劑7個(gè)特征峰均能在藥材和飲片中檢出，說明這些成分都來源于藥材；同時(shí)丹參配方顆粒和標(biāo)準(zhǔn)煎劑中都能檢出7個(gè)特征峰，說明顆粒和標(biāo)準(zhǔn)煎劑的有效成分基本一致[7]。

3 討論

本方法考察了乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.4%冰乙酸、乙腈-0.05%磷酸3種流動(dòng)性梯度洗脫的結(jié)果，其中乙腈-0.4%磷酸梯度洗脫分離條件下色譜峰多，且理論板數(shù)、分離度、對(duì)稱性均更好。同時(shí)分別比較了檢測(cè)波長(zhǎng)為210、230、254、286、310、326nm下的色譜峰，而在286nm下的色譜峰數(shù)較多且各峰之間的分離度較好，信息量大。最終選擇乙腈-0.4%磷酸梯度洗脫作為流動(dòng)性，以286nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

丹參配方顆粒的特征圖譜在10min之前的峰數(shù)多于丹參飲片和丹參標(biāo)準(zhǔn)煎劑，這部分成分還有待研究。

丹參飲片樣品、標(biāo)準(zhǔn)煎劑以及顆粒樣品都是水提制備樣品。其中丹參飲片樣品加適量水煎煮1 h是為了保證其中的水溶性成分能夠有效溶出。標(biāo)準(zhǔn)煎劑是按照國家中醫(yī)藥管理局關(guān)于印發(fā)醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范的通知(國中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3號(hào))中第四章煎藥操作方法制備。丹參配方顆粒是以水為溶媒，經(jīng)現(xiàn)代技術(shù)提取、濃縮、干燥、制粒等工藝制備而成。三者的制備方法有差異，但是本質(zhì)上都是水溶液。

[1] 楊曉日，孫巍.中藥配方顆粒探討[J].中國藥業(yè)，2007，16(14)：60.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[3] 楊小英，馬澤通，黨宏萬，等.丹參配方顆粒中有效成分的比較[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31(4)：289-292.

[4] 賈曉斌，陳彥，施亞芳，等.HPLC法測(cè)定丹參配方顆粒中丹參素的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2003，17(3)：43-44.

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StudyonCorrelationofCharacteristicHPLCChromatogramofPieces,StandardDecoctionandFormulaGranuleofRadixSalviaeMiltiorrhizae

ZHOUWei，HUChangjiang*，DAIDerong，ZHANGXiuhuan，F(xiàn)engJian

(SichuanNeo-GreenPharmaceuticalTechnologyDevelopmentCo.Ltd,Sichuan,611930,China)

Objective：To study the correlation of characteristic HPLC chromatogram of Radix Salviae Miltiorrhizae pieces, standard decoction and formula granule, and investigate the effect of different existence forms on the chemical constituents.Methods：The Luna5u C18FLM column (250mm×4.6mm,5m) was used with acetonitrile and0.4% phosphoric acid aqueous solution as mobile phase. The detection wavelength was286nm. The flow rate was10mL/min, and the sampling rate was10μL. The characteristic HPLC chromatogram of10batch of Radix Salviae Miltiorrhizae pieces,10batch of standard decoction and10batch of formula granule were established.Results：7characteristic peaks in the HPLC characteristic chromatograms from10batches of formula granules could be tracked in the pieces and standard decoction, in the7characteristic peaks, three of them were rosemary acid，salvianolic acid B，sodium danshensu，protocatechuic aldehyde.Conclusion：The main chemical constituents of Radix Salviae Miltiorrhizae pieces,standard decoction and formula granule composition is basically identical.

Radix Salviae Miltiorrhizae pieces;standard decoction; formula granule; characteristic chromatogram

*

胡昌江，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥炮制原理及飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究；E-mail：wind_61@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.003

2015-09-15)

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項(xiàng)課題(國中醫(yī)藥科2013X07)；河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(14272504D)

*[通信作者] 高晗，助理工程師，研究方向：藥物工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究；Tel：(0311)88030066，E-mail：gaohan24637447@126.com