高旦,劉葉,惠小維,包海鷹
(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)
側(cè)柏葉烏發(fā)活性成分探究△
高旦,劉葉,惠小維,包海鷹*
(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)
目的:研究側(cè)柏葉CacluneuPlatycladi的主要化學(xué)成分對(duì)酪氨酸酶活性的影響,從而確定側(cè)柏葉烏發(fā)作用的有效組分。方法:通過提取得到側(cè)柏葉所含的揮發(fā)油、總黃酮、鞣質(zhì)以及樹脂,采用蘑菇酪氨酸酶速率氧化法體外測(cè)定酪氨酸酶活性。結(jié)果:揮發(fā)油、鞣質(zhì)均表現(xiàn)為輕度的抑制作用,而總黃酮?jiǎng)t表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用,樹脂表現(xiàn)出較強(qiáng)的激活作用。結(jié)論:側(cè)柏葉中具有烏發(fā)作用的活性組分可能是樹脂。
側(cè)柏葉;側(cè)柏葉化學(xué)成分;酪氨酸酶活性
側(cè)柏葉(Platycladi cacumen)又名叢柏葉,是側(cè)柏的干燥嫩枝梢及葉。中醫(yī)認(rèn)為側(cè)柏葉氣清香,味苦澀,性寒,歸肺、肝、脾經(jīng)。具有涼血止血、化痰止咳,生發(fā)烏發(fā)之功。用于吐血,魈血,咯血,便血,崩漏下血,肺熱咳嗽,血熱脫發(fā),須發(fā)早白[1]。
明代李時(shí)珍《本草綱目》中記載側(cè)柏葉“乃多壽之木,所以可以入服食。道家以之點(diǎn)湯常飲?!眰?cè)柏葉作為傳統(tǒng)的中藥,其烏發(fā)功能一直被人忽略。而在諸多古代文獻(xiàn)中記載其主要功能為烏發(fā)和生發(fā),在《本草綱目》中謂其:浸油,生發(fā),燒汁,黑發(fā)。和豬脂,沐發(fā)長(zhǎng)黑。然而側(cè)柏葉烏發(fā)的機(jī)理尚不明確[2]。
白發(fā)的病因與發(fā)病機(jī)理復(fù)雜,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為,可能與遺傳、衰老、疾病等導(dǎo)致的黑素干細(xì)胞衰老、黑素細(xì)胞減少等有關(guān),機(jī)制包括bcl-2基因缺失、氧化損傷、氧化應(yīng)激、微量元素缺乏等。其中,酪氨酸酶(tyrosinase)表達(dá)量減少或活性降低是一個(gè)重要的因素[3-4]。酪氨酸酶是體內(nèi)黑素合成的主要限速酶,酪氨酸酶活性降低將使體內(nèi)黑素合成的反應(yīng)進(jìn)行得十分緩慢[5]。目前研究表明,側(cè)柏葉主要含有黃酮、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、樹脂、微量元素等化學(xué)成分[2],本實(shí)驗(yàn)選側(cè)柏葉的主要化學(xué)成分進(jìn)行研究,考察側(cè)柏葉是否通過某種化學(xué)成分直接激活酪氨酸酶的催化活性而促進(jìn)黑色素的形成,為進(jìn)一步研究側(cè)柏葉的烏發(fā)機(jī)理提供參考依據(jù)。
1.1 藥品
側(cè)柏葉購(gòu)自山東省濟(jì)寧市側(cè)柏種植基地,經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院包海鷹教授鑒定為側(cè)柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉。
1.2 試劑
蘑菇酪氨酸酶(tyrosinase)、L-多巴(L-Dopa)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;磷酸酶氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醇、石油醚、乙酸乙酯均為分析純。
1.3 儀器
721型分光光度計(jì)(上海第三儀器分析廠)。
2.1 磷酸緩沖溶液(PBS)的配制
稱取0.2 mol·mL-1磷酸二氫鈉溶液250 mL,加0.2 mol·mL-1的氫氧化鈉溶液118 mL,用水稀釋至1000 mL,定容,即得。
2.2 酪氨酸酶溶液的配制
稱取13.28 g(25 KU)蘑菇酪氨酸酶(1881 U·mg-1),用PBS定容至25 mL,即1 KU·mL-1,分裝-20 ℃保存,臨用時(shí)室溫平衡,即得,稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度143 U·mL-1。
2.3 L-多巴溶液的配制
精密稱取197.19 mg L-多巴,用PBS溶液定容至100 mL,須現(xiàn)用現(xiàn)配,濃度為197.19 g·mol-1。
2.4 側(cè)柏葉中總黃酮的提取
稱取側(cè)柏葉2.5 kg,用65%乙醇回流提取2次,提取時(shí)間1.5 h,每次料液比1∶15,合并提取液,離心取上清液,濃縮干燥得浸膏,在室溫下干燥,備用。取部分干燥后的乙醇提取物,加一定量的蒸餾水稀釋,依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,在室溫下干燥,備用。稱取部分乙酸乙酯萃取物,用10%乙醇溶解,離心(3000 r·min-1),用AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行純化,得到的純化產(chǎn)物置于干燥器中保存?zhèn)溆?,即為?cè)柏葉中的總黃酮。
2.5 側(cè)柏葉中揮發(fā)油的提取
稱取新鮮的側(cè)柏葉2.5 kg,用石油醚(30~60 ℃)進(jìn)行回流提取,提取時(shí)間3 h,料液比1∶12.5,合并提取液濃縮,干燥。取干燥后的適量提取物,放入揮發(fā)油提取器中,用水蒸氣蒸餾法進(jìn)行提取,得黃色透明液體1.2 g。
2.6 側(cè)柏葉中樹脂的提取
按照上述揮發(fā)油的提取工藝,提取揮發(fā)油后剩余的提取液,干燥濃縮,即為側(cè)柏葉中的樹脂成分。
2.7 側(cè)柏葉中鞣質(zhì)的提取
稱取新鮮的側(cè)柏葉2.5 kg,用65%的含水丙酮在室溫下高速攪碎機(jī)內(nèi)破碎成勻漿狀,甩濾,反復(fù)操作3次,合并濾液,減壓濃縮,得到粗的總鞣質(zhì)。
2.8側(cè)柏葉中主要化學(xué)成分對(duì)酪氨酸酶活性的影響
將上述提取所得到的主要化學(xué)成分用適量二甲基亞砜溶解,然后用PBS定容,制成濃度分別為10、20、30 mg·mL-1的3個(gè)濃度梯度。以L-多巴溶液為底物,在3 mL的PBS的測(cè)活體系中,先加入0.1 mL不同濃度的提取物于比色杯中,再加入2.8 mL預(yù)先在37 ℃恒溫水浴保溫的底物溶液,然后加入0.1 mL蘑菇酪氨酸酶溶液,立刻混勻,在37 ℃恒溫條件下測(cè)定波長(zhǎng)為475 nm的吸光度值[6]。
根據(jù)在475 nm下的吸光度值,計(jì)算側(cè)柏葉的主要化學(xué)成分對(duì)酪氨酸酶的激活率(%),并將酶活性激活率(%)達(dá)到50%時(shí)激活劑的濃度測(cè)定為IC50值。同時(shí)以不加樣品的測(cè)活體系為空白對(duì)照。激活率(%)可以根據(jù)下式進(jìn)行:
激活率=[(C-D)-(A-B)]/(A-B)
其中:A=A475-藥+酶;B=A475-藥-酶;
C=A475+藥+酶;D=A475+藥-酶
2.9 數(shù)據(jù)分析
側(cè)柏葉中揮發(fā)油、總黃酮、總鞣質(zhì)、樹脂對(duì)酪氨酸酶活性的影響見表1~4。
表1 側(cè)柏葉中揮發(fā)油對(duì)酪氨酸酶活性的影響
表2 側(cè)柏葉中總黃酮對(duì)酪氨酸酶活性的影響
表3 側(cè)柏葉中總鞣質(zhì)對(duì)酪氨酸酶活性的影響
表4 側(cè)柏葉中樹脂對(duì)酪氨酸酶活性的影響
由表1可知,側(cè)柏葉中的揮發(fā)油對(duì)酪氨酸酶有輕度的抑制作用,并且抑制作用隨著濃度增大有逐漸增大的趨勢(shì)。
由表2可知,側(cè)柏葉中的總黃酮對(duì)酪氨酸酶有顯著抑制作用,并且在藥物濃度達(dá)到30 mg·mL-1時(shí),抑制率達(dá)113.34%,與陳興芬報(bào)道的側(cè)柏葉中總黃酮對(duì)酪氨酸酶的抑制作用隨黃酮濃度的增大而增大基本一致[2]。由表3可知,側(cè)柏葉中的鞣質(zhì)對(duì)酪氨酸酶也有輕度的抑制作用。由表4可知,側(cè)柏葉中的樹脂對(duì)酪氨酸酶有顯著的激活作用,在藥物濃度達(dá)到30 mg·mL-1時(shí),激活率達(dá)102.13%,這與《本草綱目》中“浸油,生發(fā),燒汁,黑發(fā)。和豬脂,沐發(fā)長(zhǎng)黑”的記載不謀而合。
側(cè)柏葉中的樹脂類成分對(duì)酪氨酸酶有顯著的激活作用,可能是側(cè)柏葉一直作為烏發(fā)中藥的活性成分,但其活性單體成分有待進(jìn)一步探究。
[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:215-216.
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StudiesonCharacteristicofHairBlackingIngredientinCacumenPlaycladi
GAO Dan,LIUYe,HUIXiaowei,BAOHaiying*
(CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)
Objective:To study the main chemical compositions of Cacumen Platycladieffect on tyrosinase activity,so as to determine the Cacumen Platycladiufa role of effective component.Methods:Volatile oil,flavonoids,tannins and resin were extracted from Cacumen Platycladiis,tyrosinase activity was measured by the rate of mushroom tyrosinase oxidation methodinvitro.Results:The volatile oil,the tannins were characterized by mild inhibitory effect,and inhibition of flavonoids was stronger,resin showed stimulating effect.Conclusion:The hair blacking role of Cacumen Platycladi,may be due to the resin.
Cacumen Platycladi;chemical compositions of Cacumen Platycladi;activity of tyrosinase
2015-09-24)
吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金(20150320)
*
包海鷹,教授,研究方向:中藥學(xué);E-mail:baohaiying2008@126.com
10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.014