彭丹 ，宋麗 ，陳澤慧 ，董澤令 ，周小仙 ，陳安林 ，李亞男

（1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)學院，貴州 遵義 563003）

鞣質聯合環(huán)丙沙星對鮑曼不動桿菌生物膜形成的影響*

彭丹1，宋麗2，陳澤慧1，董澤令1，周小仙2，陳安林1，李亞男2

（1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)學院，貴州 遵義 563003）

目的 研究石榴皮提取物鞣質聯合環(huán)丙沙星（CIP）對鮑曼不動桿菌（Ab）生物膜形成的影響。方法采用2倍稀釋法測得石榴皮提取物鞣質和CIP對Ab ATCC19606的最低抑菌濃度（MIC）；將1/2MIC、MIC、2MIC濃度的鞣質和CIP單獨及聯合用藥作用于Ab生物膜4、8、24和48 h，采用結晶紫法和熒光顯微鏡法觀察生物膜的形成。結果 鞣質和CIP對Ab的MIC值為1.95和0.50 mg/ml；聯合用藥較單獨用藥對Ab生物膜的形成影響大，且2MIC鞣質+2MIC CIP聯合作用24 h，對生物膜形成影響最大。結論 石榴皮提取物鞣質和CIP聯合用藥對生物膜形成的影響比單獨用藥明顯，且2MIC鞣質+2CIP聯合用藥對Ab生物膜作用24 h影響效果最佳。

鮑曼不動桿菌；生物膜；石榴皮提取物鞣質；環(huán)丙沙星

鮑曼不動桿菌（acinetobacter baumanni，Ab）為革蘭陰性非發(fā)酵菌，廣泛存在于自然界、醫(yī)院環(huán)境及健康人的皮膚；該菌生存力及黏附力極強，可長期定植于醫(yī)院，易形成生物膜，使耐藥性大大增加，導致感染難以控制[1]。生物膜是細菌生長過程中為適應環(huán)境的一種優(yōu)勢生存方式。生物膜一旦形成，保護細菌不受抗菌藥物和消毒劑的影響，其膜內細菌耐藥性比浮游菌增加10～1 000倍[2]。如今，新開發(fā)一種抗生素周期長，不利于感染的控制，而且西藥容易產生耐藥，那么尋找新的治療方案刻不容緩。我國中草藥資源豐富，來源范圍廣、價格便宜、毒副作用小、不輕易產生耐藥性、在病原體內有多方面的作用及藥效，為西藥抗菌藥物之后的一個新藥方向。相關文獻報道，五倍子、大蒜素、苦參等中藥影響細菌生物膜[3-5]。鞣質是石榴皮主要成分，主要藥理作用是收斂、抗菌，本實驗將研究其是否對生物膜有破壞作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 實驗菌株：鮑曼不動桿菌ATCC1 9606；質控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923，以上購自上海寶錄生物有限公司。

1.1.2 藥物 石榴皮購自遵義樹林大藥房，經遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科鑒定為合格品；環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）購自上海生工生物工程有限公司。1.1.3 主要儀器及試劑 日本Olympus熒光顯微鏡，法國梅里埃公司的VITEK2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析儀、配套藥敏卡，北京百靈威科技有限公司結晶紫，美國Thermo酶標儀等。

1.2 方法

1.2.1 鞣質的提取及原液的制備 石榴皮粉碎后，經過加熱回流法提取鞣質，粗提物分別經5%三氯化鐵乙醇溶液和紫外分光光度計做定性和定量檢測，按照2010版藥典以沒食子酸的含量作為質控標準；鞣質提取成功后，稱取0.1875 g溶于3 ml M-H肉湯中，配制濃度為62.50 mg/ml。

1.2.2 鞣質對Ab最低抑菌濃度的測定 將Ab ATCC19606配制成0.5麥氏菌液濃度，然后將菌液稀釋100倍；準備8支無菌試管，1～6號試管分別加入1 ml肉湯，將1 ml鞣質原液加入1號試管，混勻后再吸出1 ml于第2管，依次進行2倍稀釋，6號管吸出1 ml棄去；7號管作為陰性對照，8號管為陽性對照，進行孵育培養(yǎng)，觀察最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.2.3 CIP原液的配制 使用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀，使用大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC259 23進行質控，用藥敏卡檢測CIP對Ab的藥敏結果，根據其敏感范圍（＜1μg/μl），稱取 0.04 g CIP，溶于10ml M-H肉湯當中，配制濃度為4mg/ml CIP溶液。

1.2.4 CIP對Ab的MIC測定 將Ab ATCC19606配制成0.5麥氏菌液濃度，然后將菌液稀釋100倍；準備8支無菌試管，1～6號試管分別加入1 ml肉湯，將1 ml CIP原液加入1號試管，混勻后再吸出1 ml于第2管，依次進行2倍稀釋，6號管吸出1 ml棄去；7號管作為陰性對照，8號管為陽性對照，進行孵育培養(yǎng)，觀察MIC值。

1.2.5 生物膜的建立 吸取一定量菌液濃度為1×106CFU/ml的Ab加入孔板內，37℃靜置培養(yǎng)48 h，形成生物膜。

1.2.6 結晶紫微孔板法 將形成生物膜的孔板內加入 100 μl 1/2MIC、1MIC、2MIC 鞣質溶液，1/2MIC、1MIC、2MIC的CIP溶液，以及聯合用藥鞣質和CIP各50 μl，100 μl PBS 為對照組，37℃分別培養(yǎng) 4、8、24和48 h，在相應的時間將抗菌藥物吸出，清洗掉抗菌藥物；每孔加入200 μl 0.25 g/L結晶紫染液，染色20 min，洗掉多余的染液；每孔加入200 μl 95%乙醇脫色15 min，酶標儀檢測微孔板在570 nm處的光密度值。

1.2.7 FITC-ConA標記顯微鏡技術 將形成生物膜的孔板中加入1ml 1/2MIC、1MIC、2MIC鞣質溶液，1/2MIC、1MIC、2MIC 的 CIP 溶液，以及聯合用藥鞣質和CIP各0.5 ml。對照孔加入1 ml無菌PBS溶液，37℃培養(yǎng)24 h；用50 μl FITC-ConA熒光染料染色，在熒光顯微鏡波長為480 nm處觀察不同濃度鞣質和CIP對Ab生物膜形成的影響。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鞣質和CIP對Ab的MIC值

石榴皮提取物鞣質和CIP對Ab ATCC19696的MIC分別為1.95和和0.50 mg/ml。

2.2 鞣質和CIP對Ab已形成生物膜的破壞作用

2.2.1 結晶紫微孔板法結果 各組4、8、24和48 h對生物膜形成影響比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。單用組對形成的生物膜作用4 h后，與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；單用組作用8 h后，不同濃度的CIP與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而不同濃度的鞣質單用組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；單用組分別作用24和48 h后，不同濃度的鞣質、CIP單用組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同濃度的鞣質和CIP聯合組對Ab生物膜的影響，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且隨著藥物濃度逐漸增加，光密度值逐漸降低，其中以2MIC鞣質+2MIC CIP組作用24 h效果最好。見附表和圖1。

附表 不同藥物組合對Ab生物膜形成的影響 （±s）

附表 不同藥物組合對Ab生物膜形成的影響 （±s）

注：1）與空白組比較，P ＜0.05；2）與鞣質、CIP 單用組比較，P ＜0.05

組別 4 h 8 h 24 h 48 h空白組 2.01±0.24 2.15±0.13 2.20±0.42 2.23±0.48 1/2MIC鞣質組 1.71±0.28 1.76±0.251） 1.63±0.141） 1.65±0.231）MIC鞣質組 1.58±0.43 1.54±0.511） 1.53±0.221） 1.62±0.171）2MIC鞣質組 1.62±0.18 1.68±0.181） 1.66±0.451） 1.58±0.281）1/2MIC CIP組 1.94±0.31 1.90±0.18 1.71±0.301） 1.73±0.321）MIC CIP組 1.87±0.17 1.88±0.16 1.76±0.191） 1.86±0.311）2MIC CIP組 1.90±0.42 1.94±0.41 1.74±0.251） 1.63±0.181）1/2MIC鞣質 +1/2MIC CIP 組 1.45±0.441）2） 1.43±0.471）2） 1.33±0.331）2） 1.23±0.381）2）1/2MIC 鞣質 +MIC CIP 組 1.45±0.141）2） 1.36±0.401）2） 1.34±0.341）2） 1.15±0.141）2）1/2MIC鞣質 +2MIC CIP 組 1.30±0.251）2） 1.31±0.161）2） 1.21±0.381）2） 1.11±0.321）2）MIC鞣質 +1/2MIC CIP 組 1.14±0.301）2） 1.12±0.281）2） 0.73±0.191）2） 0.72±0.241）2）MIC鞣質 +MIC CIP 組 1.08±0.141）2） 1.06±0.341）2） 0.76±0.241）2） 0.66±0.261）2）MIC鞣質 +2MIC CIP 組 1.03±0.291）2） 1.03±0.251）2） 0.65±0.351）2） 0.68±0.171）2）2MIC鞣質 +1/2MIC CIP 組 0.87±0.111）2） 0.85±0.271）2） 0.51±0.221）2） 0.53±0.301）2）2MIC 鞣質 +MIC CIP 組 0.83±0.271）2） 0.84±0.331）2） 0.48±0.131）2） 0.49±0.161）2）2MIC 鞣質 +2MIC CIP 組 0.76±0.141）2） 0.72±0.141）2） 0.40±0.171）2） 0.46±0.11）2）F值 1602.32 820.61 478.50 520.13 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 不同藥物組合對Ab生物膜形成的影響

2.2.2 FITC-ConA標記顯微鏡技術結果 不同濃度的鞣質和CIP單用及聯合用藥對Ab生物膜作用24 h后，經FITC-ConA熒光染色后在熒光顯微鏡480 nm處觀察細菌生物膜的形成情況。空白組、不同濃度鞣質和CIP單用，顯微鏡下均可見大片明亮綠色熒光；當1/2MIC鞣質與不同濃度CIP聯用后，可見較疏松的綠色熒光；1MIC鞣質與不同濃度CIP聯用后，可見篩網狀綠色熒光；2MIC鞣質與不同濃度的CIP聯用后，綠色熒光明顯減少，以2MIC鞣質與2MIC CIP聯用作用最明顯。見圖2。

圖2 不同藥物組合對Ab生物膜形成的影響（熒光顯微鏡×400）

3 討論

近年來Ab發(fā)病率和致病率日趨增多，且對多種抗菌藥物耐藥，其主要的原因之一是產生生物膜。有研究表明，Ab的耐藥性與生物膜的產生密切相關，膜內細菌耐藥性比浮游菌增加10～1 000倍，給臨床抗感染帶來極大挑戰(zhàn)和困難[6]。目前使用較為廣泛的藥物就是抗生素，但是單獨使用某種抗生素，Ab很快出現耐藥；而且新開發(fā)一種抗生素周期長，很不利于感染的控制，聯合用藥成為目前首選方案。石榴皮提取物鞣質，具有收斂、抗菌作用。本課題組前期研究發(fā)現鞣質對Ab具有較好的抑菌效果；CIP為合成的第3代喹諾酮類，為治療Ab感染常用藥物。國內學者殷網虎等[7]研究白藜蘆醇對Ab生物膜具有破壞作用；史鵬等[8]研究得出抗菌肽LL-37對Ab生物膜具有破壞作用；國外學者LUíS等[9]研究沒食子酸、咖啡酸及綠原酸對葡萄球菌生物膜的破壞作用；ALVES等[10]研究芫荽精油成分對Ab生物膜的影響。

本實驗通過結晶紫微孔板法和FITC-ConA標記顯微鏡技術，探討石榴皮提取物鞣質與CIP單獨及聯合用藥對生物膜的作用。在結晶紫微孔板法中，單用組對生物膜作用4h后，與空白組比較無差異；單用組作用8 h后，不同濃度的CIP單用組與空白組比較無差異，不同濃度的鞣質單用組比較有差異；單用組在分別作用24和48 h后，不同濃度的鞣質和CIP單用組與空白組比較有差異。不同濃度的鞣質和CIP聯用對Ab生物膜形成，與空白組比較有差異。聯合用藥對生物膜形成影響較為明顯。FITC-ConA標記顯微鏡技術結果標明，空白組、不同濃度鞣質和CIP單用，顯微鏡下均可見大片明亮綠色熒光；當1/2 MIC鞣質與不同濃度的CIP聯用后，可見較疏松的綠色熒光；1MIC鞣質與不同濃度的CIP聯用后，可見篩網狀綠色熒光；2MIC鞣質與不同濃度的CIP聯用后，綠色熒光明顯減少，以2MIC鞣質與2MIC CIP聯用作用最明顯。聯合用藥對生物膜影響明顯。

本研究只進行了體外實驗，以后還需進行體內實驗，最終為控制Ab的感染提供科學依據。

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[10]ALVES S,DUARTE A,SOUSA S,et al.Study of the major essential oil compounds of coriandrum sativum against acinetobacter baumannii and the effect of linalool on adhesion,biofilms and quorum sensing[J].Biofouling,2016,32(2):155-165.

Tannin combination with Ciprofloxacin could effect on biofilm ofAcinetobacter baumanni*

Dan Peng1,Li Song2,Ze-hui Chen1,Ze-ling Dong1,Xiao-xian Zhou2,An-lin Chen1,Ya-nan Li2
(1.The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563000,China;2.Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563003,China)

Objective To explore the effect of tannin extracted from Pomegranaterind combined with Ciprofloxacin (CIP)on thebiofilm ofAcinetobacterbaumanni (Ab).MethodsTheminimalinhibitory concentrations (MIC)of tannin and CIP to Ab ATCC19606 were determined by broth dilution method.The 1/2MIC,MIC and 2MIC of tannin,CIP and their combination acted on Ab for 4,8,24 and 48 h,respectively;then the biofilm formation of Ab was observed by crystal violet staining assay and fluorescence microscopy.Results The MIC of tannin and CIP to Ab ATCC19606 were 1.95 mg/ml and 0.50 mg/ml respectively.The effect of tannin or CIP separately on the biofilm of Ab was weaker than that of their combination.And their combination could have some effect on the biofilms,of which the combined use of 2MIC tannin and 2MIC CIP for 24 h had the greatest effect on biofilm formation of Ab.Conclusions Combined use of tannin extracted fromPomegranaterind and CIP has more obvious effect on the biofilm formation of Ab,moreover,the combination of 2MIC tannin and 2MIC CIP for 24 h has the best effect.

Acinetobacter baumanni;biofilm;tannin extracted fromPomegranaterind;Ciprofloxacin

R446.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.006

1005-8982（2017）26-0030-05

2017-01-04

貴州省科技廳合作計劃[No：黔科合 LH（2015）7480）]；遵義醫(yī)學院基金[No：院字（2009）22 號][

陳澤慧，E-mail：941291773@qq.com

（童穎丹 編輯）