李娟 ，譚鋼 ，吳安花 ，楊啟晨 ，葉蕾 ，王亞虹 ，邵毅

（1.陜西省西安市第四醫(yī)院 眼科，陜西 西安 710004；2.南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院 眼科，湖南 衡陽 421001；3.廈門大學(xué)眼科研究所，福建 廈門 361102；4.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 眼科，江西 南昌 330006；5.陜西省西安市環(huán)境監(jiān)測站，陜西 西安 710054）

大氣顆粒物PM10對小鼠淚膜功能和角膜上皮組織結(jié)構(gòu)的影響*

李娟1，譚鋼2，吳安花2，楊啟晨3，葉蕾4，王亞虹5，邵毅4

（1.陜西省西安市第四醫(yī)院 眼科，陜西 西安 710004；2.南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院 眼科，湖南 衡陽 421001；3.廈門大學(xué)眼科研究所，福建 廈門 361102；4.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 眼科，江西 南昌 330006；5.陜西省西安市環(huán)境監(jiān)測站，陜西 西安 710054）

目的 研究大氣顆粒物PM10對小鼠淚膜功能和角膜上皮組織結(jié)構(gòu)的影響。方法 24只雄性6～8周齡BALB/c小鼠，隨機(jī)分為A、B組，每組12只?？瞻讓φ战M6只不作處理。B組采用5 mg/ml PM10點(diǎn)眼，A組采用無菌PBS點(diǎn)眼，3次/d。分別在干預(yù)前及干預(yù)第1、4和7天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)小鼠淚膜功能相關(guān)檢查，包括采用酚紅棉線法檢查淚液分泌量、淚膜破裂時間（BUT）、熒光素染色及熒光素染色評分（FL）。根據(jù)分組于相應(yīng)時間點(diǎn)收集其角膜組織，行蘇木精-伊紅染色及透射電子顯微鏡下觀察角膜上皮組織結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果 干預(yù)4和7 d后，A組淚液分泌量、BUT、FL較干預(yù)前無明顯變化（P＞0.05），而B組淚液分泌量減少、BUT、FL較干預(yù)前惡化（P＜0.05）。點(diǎn)眼7 d后，A組上皮細(xì)胞為（5±1）層，B組為（7±1）層，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。電鏡觀察可見A組角膜上皮微絨毛呈指狀突起，微絨毛數(shù)量多，排列整齊；而B組角膜上皮微絨毛減少、變短、排列紊亂。結(jié)論 PM10會影響小鼠淚膜功能，小鼠淚液量分泌減少，淚膜穩(wěn)定性下降；小鼠角膜上皮組織結(jié)構(gòu)損壞。

PM10；淚膜功能；角膜上皮

空氣污染已成為世界許多地區(qū)一個重要的公共衛(wèi)生問題。越來越多的流行病學(xué)和臨床證據(jù)表明，污染物使人群各種疾病的患病率增加[1]。大氣顆粒物（particular matter，PM）是不同大小和化學(xué)特征的液體和固體材料的混合物，包括釋放到空氣中的灰塵、污垢、煙塵、吸煙及液滴等。顆粒物依據(jù)其動力學(xué)直徑，將空氣動力學(xué)直徑≤10μm的固體顆粒物稱為PM10，主要由含碳物質(zhì)、有機(jī)質(zhì)、元素碳的總和、有機(jī)物組成[2]。PM10主要來源于人為燃燒、排放等過程。因?yàn)镻M10是目前霧霾的主要成分，可能對人體健康產(chǎn)生負(fù)面影響，因此對PM10的監(jiān)測和研究很重要。眼球作為機(jī)體的一個重要器官，眼表直接暴露于外界。本研究旨在探究PM10滴眼液對正常小鼠淚膜功能和角膜上皮組織結(jié)構(gòu)的影響，為臨床防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取30只BALB/c雄性小鼠（18～22 g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心），為無特定病原體級實(shí)驗(yàn)動物（SPF級動物）。使用裂隙燈顯微鏡及眼底鏡檢查眼前節(jié)、眼底無異常。30只小鼠置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境：室溫（25±1）℃，濕度（60±10）%，12 h 晝 /夜循環(huán)照明（8∶00～20∶00）[3]。所有小鼠都給予相同的水量和食物。本研究所涉及的研究方法均遵循《赫爾辛基宣言》，動物實(shí)驗(yàn)符合視覺與眼科協(xié)會規(guī)定的對動物眼科和視覺研究的使用，同時獲得西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)[4]。

1.1.2 主要試劑及儀器 TH-16A 4通道大氣顆粒物智能采樣儀（武漢天虹儀表有限責(zé)任公司），聚四氟乙烯濾膜（美國Whatman公司），酚紅棉線（天津晶明醫(yī)用器材公司），熒光素鈉（廣州白云山明興制藥有限公司）。H-7650透射電子顯微鏡（德國HITACHI公司），裂隙燈顯微鏡（蘇州66視覺科技股份有限公司），游標(biāo)卡尺（上海儀器一廠）。

1.2 方法

1.2.1 PM10混懸液的制備 ①PM10的采集：PM10由西安環(huán)境監(jiān)測站提供（2015年10月1日-2015年10月31日，于西安市某超級站采用智能采樣儀，切割粒徑為10μm，采用聚四氟乙烯濾膜進(jìn)行采樣。采樣時間為當(dāng)天10∶30至次日8∶30，22 h/d連續(xù)采樣）。將載有PM10的聚四氟乙烯濾膜裁剪為1.0 cm×1.0 cm，浸入蒸餾水中，超聲振蕩45 min/次，共3次，用6層紗布濾過，真空下冷凍干燥、稱重，4℃冰箱保存?zhèn)溆?；②PM10混懸液的制備：使用前，PM10稀釋于無菌的PBS中，濃度為5 mg/ml，用超聲漩渦處理。加入保存劑苯扎溴銨，其濃度控制在0.005%，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 24只雄性6～8周齡BALB/c小鼠，隨機(jī)分為A、B兩組，每組12只，均為右眼。A組采用PBS點(diǎn)眼，B組采用5 mg/ml PM10混懸液點(diǎn)眼，3次/d，空白對照組6只不點(diǎn)眼，作為正常對照組。分別在干預(yù)前及干預(yù)后1、4和7 d各時間檢測并觀察實(shí)驗(yàn)小鼠的淚液分泌量、淚膜破裂時間（break-up time，BUT）、熒光素染色（fluorescein stain test，F(xiàn)L）及其評分。干預(yù)7 d后，行角膜蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）觀察小鼠角膜上皮情況，以及透射電子顯微鏡下觀察小鼠角膜上皮組織超微結(jié)構(gòu)變化下的角膜上皮情況。

1.2.3 酚紅棉線試驗(yàn) 取酚紅棉線，一端置于小鼠右眼外眥中外1/3處，計(jì)時60 s。用游標(biāo)卡尺測量酚紅棉線紅色部分的長度，計(jì)算淚液分泌量。進(jìn)行每次檢查時應(yīng)注意控制變量，應(yīng)由同一人在相同的時間、地點(diǎn)，相同的照明亮度、濕度及溫度下操作[5]。

1.2.4 BUT檢測 參照文獻(xiàn)[3]，使用1滴1%熒光素鈉滴眼，使其瞬目，在裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察記錄角膜染色區(qū)出現(xiàn)第1個破裂點(diǎn)的時間[6]。每次檢查時應(yīng)注意控制變量，由同一人在相同的時間、地點(diǎn)，相同的照明亮度、濕度及溫度下操作。

1.2.5 FL及評分 使用1滴1%熒光素鈉滴眼，使其瞬目，參考國家眼科研究臨床干眼評分系統(tǒng)[7]，分為0～3級：＜30個輕微點(diǎn)狀染色斑點(diǎn)為0級；＜30個非分散點(diǎn)狀染色斑點(diǎn)為1級；嚴(yán)重彌漫性染色，而無陽性斑塊為2級；熒光素斑塊為3級。

1.2.6 透射電子顯微鏡 參照文獻(xiàn)[8]，角膜標(biāo)本經(jīng)2.5%戊二醛前固定2 h，1%鋨酸后固定1 h，乙醇梯度脫水、包埋。經(jīng)枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色后于透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組干預(yù)前后各項(xiàng)干眼檢測指標(biāo)比較

2.1.1 淚液分泌量 兩組干預(yù)前、干預(yù)后1、4和7 d淚液分泌量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時間淚液分泌量有差異（F=12.658，P=0.004）；②兩組淚液分泌量有差異（F=23.852，P=0.001），B組較A組淚液分泌量低，淚液分泌破壞明顯；③A組與B組的淚液分泌量變化趨勢有差異（F=10.452，P=0.002）。兩組干預(yù)前淚液分泌量比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)后1d，兩組淚液分泌量比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干預(yù)后4和7 d，A組淚液分泌量較干預(yù)前無變化（t=0.432和 0.547，P=0.486和 0.336），而B組淚液分泌量較干預(yù)前惡化（t=3.781和6.453，P=0.001和0.000）；干預(yù)后4和7 d，兩組淚液分泌量比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.064和 4.596，P=0.002 和 0.000）。見表 1。

表1 兩組干預(yù)前后不同時間淚液分泌量比較（n=12，mm/min，±s）

表1 兩組干預(yù)前后不同時間淚液分泌量比較（n=12，mm/min，±s）

注：?與A組、干預(yù)前比較，P＜0.05

組別 干預(yù)前 干預(yù)后1 d 4 d 7 d A 組 6.01±0.96 5.95±1.01 6.01±0.98 6.02±0.91 B 組 5.92±1.02 5.89±1.12 4.61±1.23? 2.89±1.42?

2.1.2 BUT 兩組干預(yù)前、干預(yù)后1、4和7 d BUT比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時間BUT有差異（F=11.612，P=0.002）；②兩組的 BUT有差異（F=31.521，P=0.000），B組較A 組BUT低，淚膜破壞明顯；③兩組的BUT變化趨勢有差異（F=9.214，P=0.003）。兩組干預(yù)前BUT比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)后1 d，兩組BUT比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干預(yù)后4和7 d，A組BUT較干預(yù)前無變化（t=0.432和0.527，P=0.227和0.261），而B組BUT較干預(yù)前惡化（t=5.232和 6.715，P=0.009和 0.000）；干預(yù)后 4和7 d，兩組BUT比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.498和 6.196，P=0.002和 0.001）。見表2。

表2 兩組干預(yù)前后不同時間BUT比較 （n=12，s，±s）

表2 兩組干預(yù)前后不同時間BUT比較 （n=12，s，±s）

注：?與A組、干預(yù)前比較，P＜0.05

組別 干預(yù)前 干預(yù)后1 d 4 d 7 d A 組 6.24±0.76 6.74±1.89 6.55±1.16 6.53±1.23 B 組 6.53±0.88 6.62±2.04 5.23±1.73? 3.47±1.19?

2.1.3 FL評分 A組與B組干預(yù)前及干預(yù)后1、4和7 d FL評分比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時間FL評分有差異（F=7.319，P=0.006）；②兩組的 FL評分有差異（F=19.218，P=0.001），B 組較A組FL評分高，角膜上皮破壞明顯；③兩組的FL評分變化趨勢有差異（F=8.251，P=0.004）。A組干預(yù)前與干預(yù)后1、4和7 d FL評分比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；B組干預(yù)前與干預(yù)后1 d FL評分比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)7 d后，A組FL評分較干預(yù)前無變化（t=0.772，P=0.702），而 B 組 FL評分較干預(yù)前惡化（t=6.432，P=0.002）；兩組 FL 評分比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.121，P=0.007）。見表3。

表3 兩組干預(yù)前后不同時間FL評分比較（n=12，分，±s）

表3 兩組干預(yù)前后不同時間FL評分比較（n=12，分，±s）

注：1）與 A 組比較，P ＜0.05；2）與干預(yù)前比較，P＜0.05

組別 干預(yù)前 干預(yù)后1 d 4 d 7 d A 組 0.00±0.00 0.48±0.31 0.45±0.41 0.62±0.37 B 組 0.00±0.00 0.51±0.471） 0.77±0.631）2） 5.73±2.011）2）

2.2 兩組小鼠角膜HE染色情況

HE染色顯示，正常小鼠角膜上皮由整齊排列的4～6層上皮細(xì)胞組成，基底細(xì)胞為一單層柱狀上皮細(xì)胞層，排列緊密整齊（見圖1A）。PBS滴眼液點(diǎn)眼7 d后角膜上皮層數(shù)未見增加，基底細(xì)胞仍為一單層柱狀上皮細(xì)胞層，角膜上皮厚度基本未改變，表層上皮較為完整（見圖1B），而經(jīng)過PM10混懸液點(diǎn)眼7 d后角膜上皮細(xì)胞層數(shù)開始增多，上皮厚度增加，翼狀細(xì)胞及基底細(xì)胞排列紊亂，同時伴有表層上皮細(xì)胞損傷、脫落，角膜表面欠光滑（見圖1C）。正常對照組上皮細(xì)胞為（5±1）層，治療 7 d后，A 組為（5±1）層，B組為（7±1）層，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=31.809，P=0.007），A、B 兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.541，P=0.007）（見圖 2）。

圖1 3組小鼠用不同滴眼液處理7 d后角膜染色情況 （HE染色×400）

圖2 3組小鼠用不同滴眼液處理7 d后角膜上皮細(xì)胞層數(shù)比較

2.3 兩組小鼠角膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

正常角膜上皮細(xì)胞會向外伸出許多微絨毛和微皺襞，排列整齊。A組用PBS點(diǎn)眼7 d后，透射電鏡下可見表層上皮細(xì)胞有豐富的微絨毛，呈指狀突起，排列規(guī)則（見圖3A）。B組使用PM10點(diǎn)眼7 d后，小鼠角膜上皮微絨毛明顯減少，微絨毛形態(tài)也與A組有很大差別，偶見指狀突起，大部分微絨毛變短，且排列不規(guī)則（見圖3B）。

圖3 兩組小鼠用不同滴眼液處理7 d后角膜上皮細(xì)胞微絨毛形態(tài) （醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色×30 000）

3 討論

PM10是我國主要空氣污染物之一[5]，其對人類健康的影響一直是討論的熱點(diǎn)[9]。PM10不僅直徑小，可以通過呼吸道進(jìn)入體內(nèi)[10]，而且吸附的有毒物質(zhì)，如多環(huán)芳烴類（包括萘、蒽、菲、芘等）[11]、元素碳等[12]，也會對人體健康造成損害。有研究報(bào)道，PM10可以引起呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)的癥狀，如慢性阻塞性肺氣腫、呼吸衰竭、動脈粥樣硬化、心率不齊、心肌梗死等[13-14]。PM10對眼的影響也引起人們越來越多的關(guān)注。CHANG等[15]通過對2007年～2009年非特異性結(jié)膜炎門診患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后認(rèn)為，空氣中PM10的濃度升高，會增加患者就診的概率，可能會造成非特異性結(jié)膜炎。WIWATANADATE等[16]發(fā)現(xiàn)PM10與視力模糊呈正相關(guān)。

眼部微環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持著眼的正常生理功能。作為與外界直接接觸的淚膜，對維持視力及眼睛的健康至關(guān)重要。淚膜分為3層：黏蛋白層、水液層、脂質(zhì)層。黏蛋白層約為2.5～5.0 μm，附著于角膜表面；水液層約為4μm，含有水溶性離子、蛋白質(zhì)等；最外層的脂質(zhì)層，其厚度受到外界環(huán)境的影響，約為0.015～0.160μm[17]。TORRICELLI等[18]認(rèn)為，空氣污染對眼表的影響是因?yàn)樵斐蓽I液高滲透壓和淚膜的不穩(wěn)定。淚液高滲透壓會使淚液中炎癥因子的釋放增多，從而進(jìn)一步影響上皮細(xì)胞，對上皮細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致上皮細(xì)胞凋亡、杯狀細(xì)胞丟失，以及黏蛋白表達(dá)失調(diào)。而這些變化又進(jìn)一步導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)定，繼續(xù)加重淚液的高滲透壓，形成一個惡性循環(huán)。有研究表明，當(dāng)人暴露于污染的環(huán)境中時，不僅淚膜的穩(wěn)定性會降低，而且光滑的折光系統(tǒng)也被破壞，導(dǎo)致視力降低[19]。淚膜不穩(wěn)定引起的各種眼部不適的總稱，被認(rèn)為是干眼綜合癥（dry eye syndrome，DES）[20]。常見的干眼癥狀包括：眼部不適、疼痛感、異物感、視疲勞、眼睛發(fā)紅腫脹、眼睛發(fā)癢、眼皮抽搐等[21-22]。DES還可能導(dǎo)致角膜嚴(yán)重侵蝕和繼發(fā)感染，甚至視力喪失[23]。

本實(shí)驗(yàn)中采用PM10混懸液點(diǎn)眼，模擬空氣中PM10對淚液和角膜上皮的作用，得出一部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用PM10混懸液干預(yù)4和7 d后，SIT、BUT、FL較干預(yù)前惡化，整個角膜熒光素染色增加，角膜上皮細(xì)胞層增厚，角膜表面微絨毛變短，以及數(shù)量減少，進(jìn)一步說明PM10會損傷小鼠角膜上皮。而使用PBS滴眼4和7 d后，淚液分泌量、BUT較干預(yù)前無明顯變化，兩組結(jié)果對比后說明滴用PM10可能破壞淚膜的穩(wěn)定性，從而使有害化學(xué)物質(zhì)和病原體侵襲，進(jìn)一步損傷角膜上皮細(xì)胞，導(dǎo)致干眼的形成。目前，治療干眼病一方面是通過增加淚膜的濕潤度，來彌補(bǔ)丟失的眼淚成分，以及降低淚膜的滲透壓和蒸發(fā)，從而減少干眼的相關(guān)癥狀[24]。另一方面，對于DES的某些患者，雖然眼表面微環(huán)境被破壞，但是可通過增加上皮細(xì)胞來提高眼部自身防御力，維持一個相對良好的狀態(tài)來防止感染。

綜上所述，PM10會損傷小鼠淚膜功能，影響小鼠角膜上皮組織結(jié)構(gòu)。今后筆者將進(jìn)一步研究PM10損傷眼表是否與結(jié)膜杯狀細(xì)胞的黏蛋白分泌、眼瞼腺體（包括瞼板腺和淚腺）形態(tài)變化而導(dǎo)致的淚膜黏蛋白層和脂質(zhì)層成分改變等有關(guān)。同時筆者還將積極尋找有效地防護(hù)和治療方法，以減少PM10對眼部的損害，促進(jìn)人們的眼部健康。

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Influence of air pollutant PM10on tear film and corneal epithelium in mice*

Juan Li1,Gang Tan2,An-hua Wu2,Qi-chen Yang3,Lei Ye4,Ya-hong Wang5,Yi Shao4
(1.Department of Ophthalmology,Xi'an Fourth Hospital,Xi'an,Shaanxi 710004,China;2.Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;3.Eye Institute of Xiamen University,Xiamen,Fujian 361102,China;4.Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang,Jiangxi 330006,China;5.Environmental Monitoring Station of Xi'an City,Xi'an,Shaanxi 710054,China)

Objective To investigate the influence of PM10on tear film functions and corneal epithelium in mice.Method Totally 30 male BALB/c mice at the age of 6-8 weeks (30 eyes)were divided into 3 groups:group A (PBS eye drops,n=12),group B (PM10eye drops,n=12)and blank control group (n=6).The group B used 5 mg/ml PM10eye drops,50 μl each time,3 times a day,for 7 consecutive days.The group A used sterile PBS as eye drops,3 times a day,for 7 consecutive days.The tear film function tests including tear secretion level,breakup time of tear film (BUT)and fluorescein staining and fluorescein staining score(FL)were performed before therapy and 1,4 and 7 d after treatment.On the 7th d after treatment,the corneas of all the mice were collected for HE staining and ultrastructural examination under transmission electron microscope.Results On the 1st,4th and 7th d after treatment,there was no statistical change in tear secretion level,BUT or FL in the group A (P＞0.05);but there were statistical changes in all items in the group B (P＜0.05).On the 7th d after therapy,the mean layers of corneal epithelial cells in the group A were significantly fewer than those in the group B (P＜0.05).Under electron microscope,the microvilli of corneal epithelium in the group A were finger-like and in regular arrangement;in contrast,a cluster of disordered,shorter and fewer microvilli was observed in the group B.Conclusions PM10can influence tear film functions and damage corneal epithelial structure in mice.

particular matter 10;tear film function;corneal epithelium

R772

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.002

1005-8982（2017）26-0007-06

2016-08-30

國家自然科學(xué)基金（No：81400424）；陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（No：2014K11-03-07-04）；2017年陜西省創(chuàng)新人才推進(jìn)計(jì)劃-青年科技新星項(xiàng)目（No：2017KJXX-87）

邵毅，E-mail：freebee99@163.com

（童穎丹 編輯）