鄭智慧　謝鳴坤　梁華倫　徐萬(wàn)幫

（1廣東省中醫(yī)院藥劑科，廣州510120；2廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣州510120）

決明子薄層鑒別方法改進(jìn)研究

鄭智慧1謝鳴坤1梁華倫1徐萬(wàn)幫2*

（1廣東省中醫(yī)院藥劑科，廣州510120；2廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣州510120）

目的修訂中國(guó)藥典決明子薄層鑒別方法。方法修改提取方法，參照《中國(guó)藥典》（2015版）展開(kāi)條件，進(jìn)行決明子薄層鑒別實(shí)驗(yàn)，并對(duì)修訂后的方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果所有樣品均能檢出橙黃決明素、大黃酚斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，易于檢測(cè)。結(jié)論決明子修訂后的薄層色譜鑒別方法操作簡(jiǎn)便、專(zhuān)屬性強(qiáng)、斑點(diǎn)清晰。

決明子；薄層色譜法；改進(jìn)

決明子是我國(guó)民間應(yīng)用極為廣泛的常用藥材之一，具有悠久的歷史?！侗静荼恪酚涊d決明子“主青盲，目淫膚赤白膜，眼淚出，除肝家熱，久服益精光。又解蛇毒。貼腦心止鼻洪”［1］。因此，在2005～2015版《中國(guó)藥典》中均收錄了該品種。由2005版《中國(guó)藥典》對(duì)專(zhuān)屬性不強(qiáng)的大黃酚和大黃素進(jìn)行質(zhì)量控制［2-3］，到2015版《中國(guó)藥典》對(duì)專(zhuān)屬性強(qiáng)的橙黃決明素和大黃酚進(jìn)行質(zhì)量控制，體現(xiàn)了對(duì)其內(nèi)在質(zhì)量控制的進(jìn)步。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用《中國(guó)藥典》（2015版）的操作對(duì)決明子薄層鑒別時(shí)，斑點(diǎn)不是很清晰，本實(shí)驗(yàn)在《中國(guó)藥典》（2015版）的基礎(chǔ)上，改進(jìn)提取方式和改變?nèi)軇?，以橙黃決明素和大黃酚為指標(biāo)，對(duì)決明子薄層色譜鑒別方法進(jìn)行提升。獲得較優(yōu)的測(cè)試結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下

1　儀器和試劑

1.1儀器全自動(dòng)薄層點(diǎn)樣儀（CAMAG AUTO MATIC TLC SAMPLER4）、薄層自動(dòng)成像儀（CAMAG REPROSTAR 3）

1.2試劑甲醇、鹽酸、乙醚、三氯甲烷、無(wú)水乙醇、石油醚（30～60℃）、丙酮、氨水均為分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；乙酸乙酯為分析純，購(gòu)自天津化學(xué)試劑廠；水為本實(shí)驗(yàn)室自制高純水。

橙黃決明素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111900-201303），大黃酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110796-201017）

2　實(shí)驗(yàn)步驟

2.1《中國(guó)藥典》［4］（2015版）實(shí)驗(yàn)步驟取本品粉末1g，加甲醇10m1，浸漬1h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0m1使溶解，再加鹽酸1m1，置水浴上加熱30min，立即冷卻，用乙醚提取2次，每次20m1，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄?.0m1使溶解，作為供試品溶液。另取橙黃決明素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品，加無(wú)水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）制成每1m1各含1mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μ1，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以石油醚（30～60℃）-丙酮（2∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榱咙S色（橙黃決明素）和粉紅色（大黃酚）。

2.2修訂后的實(shí)驗(yàn)步驟取經(jīng)粉碎后（過(guò)2號(hào)篩）的樣品2g，加甲醇20m1，加熱回流2h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?m1使溶解，作為供試品溶液。另取橙黃決明素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品，加甲醇制成每1m1各含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液10μ1、對(duì)照品溶液2μ1，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以石油醚（60～90℃）-丙酮（2∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榱咙S色（橙黃決明素）和粉紅色（大黃酚）。

3　結(jié)果與討論

3.1《中國(guó)藥典》方法所得薄層鑒別圖按照2.1所記載的步驟，照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，在室溫（26℃，此時(shí)RH為66%）所得薄層色譜圖如下，見(jiàn)圖1

圖1　決明子薄層鑒別（左：日光；右：氨蒸氣熏后）（藥典方法）

從圖1可以看出，采用《中國(guó)藥典》2015版所記載的方法所得到的薄層色譜圖，斑點(diǎn)不是很清晰，展開(kāi)不夠理想。所有斑點(diǎn)比較集中，不利于判斷。

3.2修訂方法后所得薄層色譜圖根據(jù)2.2所記載的方法，對(duì)修訂后的方法進(jìn)行薄層鑒別，所得結(jié)果如下（見(jiàn)圖2）

圖2　決明子薄層鑒別（左：日光；右：氨蒸氣熏后）（修訂方法）

從圖2可以看出，修訂后，決明子的薄層色譜圖能更好的將決明子中的有效成分大黃酚、大黃素甲醚、決明素、橙黃決明素等醌類(lèi)化合物［4］，同時(shí)，Rf值合理，斑點(diǎn)清晰。同時(shí)，減少了三氯甲烷的使用，降低了環(huán)境污染，避免了實(shí)驗(yàn)者的潛在傷害。

4　修訂薄層鑒別方法學(xué)考察

針對(duì)《中國(guó)藥典》（一部）（2015版）決明子項(xiàng)下的方法，采用2.2的實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)其進(jìn)行了修訂，按照《中國(guó)藥典》（四部）（2015版）中的指導(dǎo)原則對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

4.1專(zhuān)屬性考察按照2.2的方法，分別吸取決明子供試品溶液、橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品溶液10、2、2點(diǎn)樣于同一硅膠H薄層板上，以石油醚（60～90℃）-丙酮（2∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)（室溫：25℃，相對(duì)濕度：74%），取出，晾干，置日光下檢視，置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榱咙S色（橙黃決明素）和粉紅色（大黃酚），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　決明子薄層鑒別專(zhuān)屬性考察色譜圖（左：日光；右：氨蒸氣熏后）

由圖3可見(jiàn)，決明子供試品溶液色譜中，在與橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品色譜的相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，分離度良好，斑點(diǎn)清晰。

4.2不同點(diǎn)樣量的考察吸取決明子供試品溶液（批號(hào)：407376L）不同點(diǎn)樣量5、8、10、15μ1，橙黃決明素對(duì)照品溶液1、2、3、5μ1，大黃酚對(duì)照品溶液1、2、3、5μ1，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，按上述色譜條件展開(kāi)（室溫：25℃，相對(duì)濕度：74%）、取出、晾干，置日光下檢視，置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榱咙S色（橙黃決明素）和粉紅色（大黃酚），結(jié)果見(jiàn)圖4～5：

圖4　決明子薄層鑒別點(diǎn)樣量考察（批號(hào)：407376L）（日光）

圖5　決明子薄層鑒別點(diǎn)樣量考察（批號(hào)：407376L）（氨蒸氣熏后）

由圖4～5可見(jiàn)，決明子點(diǎn)樣量為10μ1、橙黃決明素對(duì)照品溶液點(diǎn)樣量為2μ1、大黃酚對(duì)照品溶液點(diǎn)樣量為2μ1時(shí)，斑點(diǎn)清晰，且不拖尾。因此，決明子點(diǎn)樣量為10μ1、橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品溶液點(diǎn)樣量各為2μ1。

4.3不同溫度考察分別吸取決明子供試品溶液以及橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品溶液點(diǎn)于同一硅膠H板上，按上述薄層色譜條件，分別在常溫（T：25℃，RH：74%）和低溫（T：6℃，RH：40%）條件下展開(kāi)，取出，晾干，置日光下檢視，置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榱咙S色（橙黃決明素）和粉紅色（大黃酚），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6～7：

圖6　常溫條件下決明子薄層鑒別色譜圖（左：日光右：氨蒸氣熏后）

圖7　低溫條件下決明子薄層鑒別色譜圖（左：日光；右：氨蒸氣熏后）

盡管由于圖7中的邊緣效應(yīng)，導(dǎo)致圖形有點(diǎn)變形，但是由圖6～7可明顯看出，常溫和低溫條件下，決明子分離效果都較好，且決明子色譜在與橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度對(duì)決明子薄層鑒別無(wú)顯著影響，說(shuō)明該薄層鑒別方法耐用性好。

4.4不同濕度考察分別吸取決明子供試品溶液和橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品溶液點(diǎn)于同一硅膠H板上，按上述薄層色譜條件，分別在高濕（T：25℃，RH：75%）和低濕（T：25℃，RH：20%）條件下展開(kāi)，取出，晾干，置日光下檢視，置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榱咙S色（橙黃決明素）和粉紅色（大黃酚），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8～9：

圖8　高濕條件下決明子薄層鑒別色譜圖（左：日光；右：氨蒸氣熏后）

圖9　低濕條件下決明子薄層鑒別色譜圖（氨蒸氣熏后）

圖10　自制H板色譜圖（左：日光；右：氨蒸氣熏后）

圖11　青島海洋化工廠所制H板色譜圖（左：日光；右：氨蒸氣熏后）

圖12　煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所所制H板色譜圖（左：日光；右：氨蒸氣熏后）

由圖8～9可知，高濕和低濕條件下，決明子分離效果都較好，在不同條件下，斑點(diǎn)均清晰，分離度良好。因此，濕度對(duì)決明子薄層鑒別無(wú)顯著影響，說(shuō)明該薄層鑒別方法耐用性好。

4.5不同廠家薄層板的考察分別吸取決明子供試品溶液、橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品溶液點(diǎn)于不同廠家硅膠H薄層板（實(shí)驗(yàn)室自制、青島海洋化工廠分廠、煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）上，按上述薄層色譜條件進(jìn)行展開(kāi)（T：25℃，RH：74%），取出，晾干，置日光下檢視，置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榱咙S色（橙黃決明素）和粉紅色（大黃酚），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖10～12：由圖10～12可知，三種不同H板對(duì)決明子薄層鑒別無(wú)顯著影響，顯色后斑點(diǎn)清晰，分離度良好。

此外，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)展開(kāi)前的飽和時(shí)間進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)飽和時(shí)間延長(zhǎng)，色譜斑點(diǎn)更清晰，建議其他實(shí)驗(yàn)者在實(shí)驗(yàn)中適當(dāng)增加飽和時(shí)間，以期獲得最佳的效果

5　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在《中國(guó)藥典》2015版決明子藥材薄層鑒別的基礎(chǔ)上，修改了提取方法，更換了對(duì)環(huán)境影響較大的三氯甲烷，采用相對(duì)環(huán)境友好的甲醇為溶劑進(jìn)行薄層鑒別，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，分離度良好，斑點(diǎn)清晰，可為更好的對(duì)決明子質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

［1］李心機(jī).《本草便》校注札記［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，38（3）：241-243.

［2］胡軟娟，萬(wàn)麗，張加雄，等.決明子藥材薄層色譜鑒別研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（11）：2129.

［3］黃小平，鐘國(guó)躍，張雪梅，等.決明子薄層鑒別方法研究［J］.中藥材，2010，33（8）：1246-1247.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：145.

［5］盧金清，黎強(qiáng)，李肖爽，等.決明子研究進(jìn)展［J］.湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16（4）：124-126.

ZHENG Zhihui1， XIE Mingkun1， LIANG Hua1un1， XU Wanbang2
（1. Department of Pharmacy， Guangdong Provincia1Hospita1of TCM Hospita1， Guangzhou 510120， China；2. Guangdong Institute of Drug Contro1， Guangzhou 510120， China）

Objective To improve the TLC method of semen cassiae in China Pharmacopoeia.Methods A new extraction method was app1ied to the TLC identification test of Semen Cassiae according to the Chinese Pharmacopoeia（2015Edition），and va1idation of the revised method was carried out.Results The spots were c1ear，and were easy to detect.Conclusion The revised TLC method of Cassia Seed is simp1e，and has strong specificity and c1ear spots.

Semen Cassiae；TLC；improvement

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.12.062

1672-2779（2016）-12-0139-04

（本文編輯：李海燕本文校對(duì)：梁偉杰2016-04-15）

wbxu@163.com