張玉娟，趙 婷，徐 朝，于 琨，馬 倩，李超燕，鄭文明，許 君

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

豬ifitm基因克隆及其序列和組織表達(dá)分析

張玉娟，趙 婷，徐 朝，于 琨，馬 倩，李超燕，鄭文明，許 君

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

為了研究ifitm基因的功能，本研究從豬腎PK15細(xì)胞中克隆了豬的3個ifitmcDNA序列，分析了豬ifitm1、ifitm2和ifitm3基因的染色體定位及其與其他物種基因序列的同源關(guān)系，并對不同ifitm在不同組織的表達(dá)進(jìn)行分析和檢測。結(jié)果顯示，豬ifitm和人、鼠ifitm具有相同的基因和蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)化上與牛ifitm高度同源，ifitm1和ifitm3在脾、腎、心、肝等組織中大量表達(dá)，而ifitm2只在脾和腎中檢測到表達(dá)，在其他組織中的表達(dá)量相對較小。豬ifitm基因的克隆、生物信息學(xué)及組織表達(dá)分析為進(jìn)一步研究其在豬細(xì)胞中的功能奠定了基礎(chǔ)。

干擾素刺激基因；豬干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白；基因克隆；基因序列；組織表達(dá)差異

干擾素(interferon，IFN) 是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有抗病毒、影響細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。IFN抗病毒生物學(xué)功能的發(fā)揮主要依賴于干擾素信號通路激活后眾多下游干擾素刺激基因(interferon stimulate gene，ISG)的表達(dá)。干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白 (interferon induced transmembrane protein，ifitm)是ISG中最引人注目的家族之一[1-3]，受干擾素刺激后可大量表達(dá)，在調(diào)控細(xì)胞增殖、抵抗病原感染等一系列細(xì)胞生物學(xué)活動中發(fā)揮著重要作用。目前，ifitm在進(jìn)化上比較保守，已在許多物種中被發(fā)現(xiàn)[4]。人類基因組中，有5個ifitm基因，其中對ifitm1、ifitm2、ifitm3和ifitm5的功能性研究較多，對ifitm10的研究鮮見報(bào)道[5]。這些基因都位于人11號染色體上，以ifitm5、ifitm2、ifitm1、ifitm3、ifitm10的順序依次排列[6-7]。其中，fitm1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化的功能，它在淋巴細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、成纖維細(xì)胞核上皮細(xì)胞中均有表達(dá)。此外，研究發(fā)現(xiàn)ifitm1在抑制大腸癌、結(jié)腸癌、胃癌等腫瘤的形成過程中具有不同程度的表現(xiàn)[8-10]。ifitm2可抑制細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，ifitm1、ifitm2、ifitm3能抗擊甲型流感病毒 (IAV)，線狀病毒(filovirus)、黃病毒(flavivirus)、SARS冠狀病毒等多種病毒的入侵[5,11-12]。且ifitm3的抗病毒活性與其S-棕櫚?；揎椨嘘P(guān)[13]。ifitm5主要表達(dá)于骨組織，對骨基質(zhì)的成熟和骨鈣化起著重要作用[14]。

鼠的ifitm基因主要定位于7號染色體，有ifitm1、ifitm2、ifitm3、ifitm5、ifitm6和ifitm10。這些基因與人ifitm有很強(qiáng)的同源性，ifitm7是定位于16號染色體上的一個擬基因[5]。也有報(bào)道鼠基因組中存在ifitm4[15]。鼠ifitm1和ifitm3在原生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)中有表達(dá)，在原腸胚形成時(shí)期參與PGCs的定位和移動，在生殖細(xì)胞的發(fā)育中起重要作用。 DNA微陣列分析技術(shù)確認(rèn)ifitm5在鼠基因組中也是一個成骨細(xì)胞標(biāo)記分子[4,6,16-17]。研究結(jié)果顯示，豬中也有ifitm基因的存在，并且對口蹄疫病毒和流感病毒具有抑制作用[19-20]。本研究，我們克隆了豬的3個ifitmcDNA序列，并對基因和蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，對3個基因的組織表達(dá)差異性進(jìn)行了定量分析，對基因序列及其同源關(guān)系進(jìn)行了對比分析。

1 材料與方法

1.1試劑

康為世紀(jì)超純RNA提取試劑盒(Ultrapure RNA Kit)；百泰克2×Power PCR MasterMix。

1.2樣品處理

豬腎細(xì)胞PK15，來自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。豬心臟、肝臟、胃、脾臟、十二指腸、腎臟、肌肉、肺等8個組織樣品采集自3只成年大約克夏豬(Yoykshire)。用4 ℃預(yù)冷的PBS清洗后，放入含有組織儲存液的EP管，-80 ℃保存。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA和RNA的提取 PK15細(xì)胞總DNA的提取按照動物組織細(xì)胞基因組DNA提取的一般方法進(jìn)行提取。PK15細(xì)胞和豬的不同組織的總RNA的提取分別按康為世紀(jì)超純RNA提取試劑盒(Ultrapure RNA Kit)的說明書進(jìn)行操作。所得的RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行完整性檢測。

1.3.2 cDNA合成、CDS區(qū)及全長基因克隆 以總RNA為模板，Oligo(dT)為引物，按逆轉(zhuǎn)錄說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。按照GeneBank 報(bào)道的人和鼠的ifitm1、ifitm2、ifitm3基因?yàn)閰⒖夹蛄?，設(shè)計(jì)特異性引物對，引物序列如表1。

表1 克隆ifitm CDS 區(qū)的引物序列Table 1 Primer sequences for ifitm CDS cloning

PCR反應(yīng)體系，Mix 10 μL，模板cDNA (或總DNA)2 μL，上、下游引物各1 μL(20 μmol·L-1)，加6 μL去離子水至總體積20 μL。 同時(shí)設(shè)置空白對照。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性1 mim；95 ℃變性30 s，退火30 s(ifitm1 54 ℃，ifitm2 47 ℃，ifitm3 58 ℃)，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，膠回收 PCR 產(chǎn)物，T4 DNA ligase 鏈接 T-Vector，轉(zhuǎn)化Ecoli.感受態(tài)細(xì)胞，Amp 抗性篩選陽性克隆，挑取白色菌落，PCR驗(yàn)證陽性克隆子，測序驗(yàn)證基因序列。將克隆的 3 個ifitm的 cDNA序列分別提交至NCBI。

1.3.3 序列對比 通過NCBI查找人類、鼠、豬、尤金袋鼠及猩猩的ifitm蛋白序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行對比。用CSS-Palm 3.0分析ifitm蛋白的棕櫚?；稽c(diǎn)。

1.3.4 基因的染色體定位 利用NCBI的Blast功能將克隆的豬ifitm1(序列號JQ315414.1)、ifitm2(序列號JQ3154145.1)和ifitm3(序列號JQ315416.1)置于豬的基因組上進(jìn)行對比，將對比結(jié)果做圖顯示。

1.3.5 組織表達(dá)分析 將采集的豬心、肝、胃、脾臟、十二指腸、腎、肌肉、肺等8個組織，分別提取RNA 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，每個樣品3次重復(fù)，以β-肌動蛋白(β-actin )表達(dá)量為參照標(biāo)準(zhǔn)，PCR測定3個基因在8個組織中的表達(dá)，以 Image J 軟件對擴(kuò)增條帶進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1基因克隆

分別以PK15逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA和總DNA為模板，ifitm1F/1R、ifitm2F/2R和ifitm3F/3R 3對引物PCR擴(kuò)增相對應(yīng)的ifitm1、ifitm2和ifitm3的CDS區(qū)和全長基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL上樣于2%瓊脂糖凝膠，電泳得到與預(yù)期片段相符的產(chǎn)物(圖1-A)。

將3個PCR產(chǎn)物回收，進(jìn)行T載體克隆，挑取陽性克隆子進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序結(jié)果顯示：ifitm1、ifitm2和ifitm3的CDS區(qū)片段長度分別為375、435 bp和438 bp，將3條基因序列測定結(jié)果提交至NCBI GeneBank,經(jīng)審核后，獲得3個 CDS序列號:ifitm1(JQ315414)、ifitm2(JQ315415)和ifitm3(JQ315416)。豬全長基因組序列比對可知ifitm1長度為 998 bp，序列已存在于全基因組，但ifitm2和ifitm3卻位于未測定序列的GAP中，我們對其進(jìn)行了克隆，測序結(jié)果顯示ifitm2和ifitm3的全長序列大小分別為1 048、1 075 bp(圖1-B)。

M：DNA分子量標(biāo)記；bp：DNA分子量；泳道編號代表不同的克隆子；CK:對照。M:DNA marker；bp:DNA molecular weight.Lane number represent different clones.CK:Control check

2.2豬ifitm基因結(jié)構(gòu)與基因定位

利用NCBI的Blast功能，將豬的ifitm1、ifitm2和ifitm3與豬的全基因組進(jìn)行對比。結(jié)果顯示(圖2-A)，豬ifitm具有與人、鼠的ifitm相似的基因結(jié)構(gòu)，ifitm1具有186 bp 和189 bp 2個外顯子和位于2個外顯子之間的長度為623 bp的1個內(nèi)含子；ifitm2具有247 bp 和188 bp 2個外顯子和長度為613 bp的1個內(nèi)含子；ifitm3具有194 bp 和244 bp 2個外顯子和位于2個外顯子之間的長度為637 bp的1個內(nèi)含子。

圖A中sifitm代表豬ifitmsifitm means swine ifitm in Fig.A

經(jīng)過比對，發(fā)現(xiàn)豬的ifitm1、2、3和5均位于2號染色體上，以ifitm3、1、2、5的順序排列(圖2-B)。與人基因組和鼠基因組中ifitm基因的染色體定位相似，但排列有所不同，并未在豬基因組中發(fā)現(xiàn)ifitm10的同源基因，只有1個類似于ifitm10擬基因，或許該基因并不存在于豬基因組中。

2.3ifitm的蛋白結(jié)構(gòu)分析與翻譯后修飾位點(diǎn)預(yù)測

由于ifitm蛋白是一種典型的跨膜蛋白，采用TMHMMT軟件對豬的ifitm1、ifitm2和ifitm3蛋白進(jìn)行跨膜域分析(圖3)。分析結(jié)果顯示，豬ifitm1、ifitm2和ifitm3都包含N段(NTD)、2個典型的跨膜區(qū)域(IMD)、位于2個跨膜區(qū)中間的胞質(zhì)區(qū)(CTL)和C段(CTD)，具有ifitm蛋白家族成員的典型結(jié)構(gòu)。文獻(xiàn)報(bào)道，ifitm有泛素化、甲基化、棕櫚酰化等與蛋白的功能密切相關(guān)的翻譯后修飾。我們采用CSS-Palm 3.0軟件分析對人(Homo)、猩猩(Chimp)、鼠(Mus)和豬(Sus)的ifitm蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列對比，同時(shí)用CSS-Palm 3.0分析各個物種這3個ifitm基因上的棕櫚酰化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)豬的3個ifitm蛋白都具有保守的S-棕櫚?；稽c(diǎn)、泛素化位點(diǎn) 、和甲基化位點(diǎn)(圖3)。從圖中可知，S-棕櫚?；稽c(diǎn)非常保守，其保守性可能與ifitm序列本身在物種中的保守度高度有關(guān)，與其先天免疫中的功能相關(guān)。

NTD:N 端區(qū)域；IMD:跨膜區(qū)域；CTL:胞脂loop；CTD:C端區(qū)域；Ubiquitiylated sithe：泛素化位點(diǎn); S-palmitoylation site：S-棕櫚?；? Methylated site：甲基化位點(diǎn).

2.4豬ifitm蛋白組織表達(dá)分析

以新鮮的豬組織(肉、骨、肝、腦、腸、心、脾和腎)提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，分別用ifitm1F/1R、ifitm2F/2R和ifitm3F/3R3對引物PCR擴(kuò)增ifitm1、ifitm2和ifitm3基因序列，同時(shí)擴(kuò)增β-actin 做內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL上樣于2 %瓊脂糖凝膠(圖4-A)，用ImageJ生物學(xué)軟件，以β-actin 擴(kuò)增條帶做內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，定量分析DNA電泳結(jié)果。從圖4可知肌肉、骨和腦中表達(dá)量較低；ifitm3在各個組織中廣泛表達(dá)；而ifitm2只在脾和腎中檢測到明顯條帶。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的物種，ifitm1/2/3在各組織中是遍在表達(dá)的，在豬的有些組織中卻沒有檢測到條帶的擴(kuò)增，推測可能是其mRNA的表達(dá)量很低，普通PCR沒有明顯的可看到的條帶，尤其是ifitm2僅在脾臟中檢測出特異性條帶，在其他組織中未檢測到有表達(dá)，與其他物種ifitm2的表達(dá)特異性具有較大差異，推測豬ifitm2可能與其他物種有所不同，這有待于進(jìn)一步研究。與人及鼠相似，豬的ifitm2和ifitm3在脾臟中高表達(dá)，可能與動物的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。

A.不同豬組織的RT-PCR 電泳結(jié)果；B.采用Image J 軟件對RT-PCR 條帶定量分析結(jié)果；1:肌肉；2:骨；3:肝；4:腦；5:小腸; 6:心臟；7:脾臟；8:腎臟；CK:對照A.Agrose electrophoresis analysis of RT-PCR; B.Quantitative analysis of RT-PCR bands using Image J soft ware.1:Muscle; 2:Bone; 3:Liver; 4:Brain; 5:Intestine; 6:Heart; 7:Spleen; 8:Kidney.CK:Control check

3 小結(jié)與討論

目前，豬肉仍是中國消費(fèi)最多的肉類。在生豬養(yǎng)殖過程中，常常容易引起流感病毒、口蹄疫病毒、乙型腦炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥等多種病毒感染，特別是一些人獸共患病毒性疾病，不僅嚴(yán)重影響了家畜養(yǎng)殖業(yè)，也對人類的健康造成極大威脅。在病毒感染的早期，由干擾素調(diào)控的豬先天抗病毒免疫發(fā)揮著重要作用。BRASS等[11]首次報(bào)道了人ifitm是可抑制流感病毒(IAV)、西尼羅河病毒(WNV)和登革熱病毒(DV)的跨膜蛋白。由此開始，在以后的幾年中，研究人員開展了人和鼠的ifitm抵抗多種病毒的研究[18]。病毒感染細(xì)胞后，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒功能的I型IFN，IFN與細(xì)胞表面的IFN受體結(jié)合后可激活JAK/STAT信號通路，從而導(dǎo)致一系列抗病毒基因的轉(zhuǎn)錄，抑制了病毒的復(fù)制和擴(kuò)散。

本研究克隆了豬的3個ifitm基因，并將其序列與其他物種進(jìn)行了比對，不僅其基因結(jié)構(gòu)蛋白序列與人的ifitm具有很高的相似性和同源性，而且具有相似的翻譯后修飾位點(diǎn)，提示豬的ifitm可能具有相類似的功能，如：S-棕櫚?；稽c(diǎn)對ifitm的抗病毒效應(yīng)起重要作用[13]，但S-棕櫚?；稽c(diǎn)是否與抗病毒效應(yīng)有關(guān)有待近一步研究。XU等[19]的最新研究結(jié)果表明，豬ifitm蛋白具有抗甲型流感病毒和口蹄疫病毒的作用，是豬ifitm抗病毒功能的有力證據(jù)。本研究所獲得的ifitm2與ifitm3序列與LANZ等[20]所報(bào)道的豬ifitm序列相同，而ifitm1 有所不同，本研究并沒有克隆到ifitm1a 和ifitm1b 2個ifitm1-like序列[20]。豬ifitm的不同組織表達(dá)分析結(jié)果顯示，在大約克夏豬中ifitm1、ifitm3在各個組織中都有表達(dá)，但在脾臟的高表達(dá)提示其與其他物種的ifitm一樣，除和機(jī)體的先天免疫有關(guān)以外，也參與細(xì)胞的多種生命活動。豬ifitm的cDNA克隆和序列及組織表達(dá)分析為后續(xù)的抗原表達(dá)研究、抗病毒、代謝機(jī)制等多項(xiàng)研究奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：朱秀英)

Cloningandanalysisofsequenceandtissueexpressionofswineifitmgene

ZHANG Yujuan,ZHAO Ting,XU Zhao,YU Kun,MA Qian,LI Chaoyan,ZHENG Wenming,XU Jun

(College of Life Sciences,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

Interferon induced transmembrane protein (ifitm),the first defensive line of organism to resist to virus infection,including many members such asifitm1,ifitm2 andifitm3,belongs to Interferon-stimulated Genes(ISGs).It can abundantly express after interferon-stimulated.Ifitmcan regulate a series of cell biological activities include the control of cell proliferation and have anti-viral function and other important roles.To explore the functions of pigifitm,we cloned and reported three differentifitmcDNAs.Bioinformatics was employed to study the chromosome location of threeifitmgenes in pig,and the homologous relationship between pig and other species.For the first time,we analyzed the difference of their gene expression in various tissues of pig.The results show that swineifitmhas the similar genetic and protein structures withifitmfrom human,mouse and other species.Swineifitmare highly evolutionary homologous to cattle.Ifitm1 andifitm3 expressed in tissues such as spleen,kidney,heart and liver etc.however,ifitm2 is only found in spleen and kidney,and extremely slight expression is detected.Cloning and analysis of bioinformatics and tissue expression established the foundation for further studies on the functions in swine.

ISGs; Procine interferon-inducible transmembrane protein of pit; gene clone； gene sequence; expression variation of different tissue

S852.4

：A

2015-08-29

河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿研究項(xiàng)目(112300410088)；河南省科技廳科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目(112102310324)；河南省教育廳科技研究重點(diǎn)項(xiàng)目(12B230007)

張玉娟(1988-)，女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事細(xì)胞分子生物學(xué)研究。

許 君(1972-)，女，河南開封人，副教授。

1000-2340(2016)03-0359-05