李斌，費(fèi)希同，唐軍榮，尹麗莎，韓國(guó)偉，辛培堯

(西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明　650224)

?

‘黃花倒水蓮’離體快繁技術(shù)研究

李斌，費(fèi)希同，唐軍榮，尹麗莎，韓國(guó)偉，辛培堯

(西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650224)

【目的】 研究并建立‘黃花倒水蓮’離體快繁技術(shù)體系.【方法】 以‘黃花倒水蓮’嫩莖為外植體，經(jīng)不同方法消毒后，接種于MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，繼而將不定芽接種在附加不同種類(lèi)及濃度外源激素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)增殖和生根情況，篩選適宜的‘黃花倒水蓮’增殖及生根培養(yǎng)基；然后將生根試管苗移栽于不同的基質(zhì)中，依據(jù)成活率，確定其最佳煉苗基質(zhì).【結(jié)果】 用75%酒精消毒10 s，0.1%升汞消毒15 min獲得了較好的消毒效果，污染率低至3.15%；適宜‘黃花倒水蓮’增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L，增殖系數(shù)為5.50；在1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+0.2 g/L 活性炭的生根培養(yǎng)基中，其生根率可達(dá)96%；‘黃花倒水蓮’試管苗煉苗的最佳基質(zhì)為紅壤∶腐殖土∶珍珠巖=1∶1∶1，成活率為94.5%.【結(jié)論】 成功建立了‘黃花倒水蓮’離體快繁技術(shù)體系.

‘黃花倒水蓮’；離體快繁；技術(shù)

‘黃花倒水蓮’(PolygalafallaxHemsl)別名黃花參、黃花吊水蓮、觀音串、黃花大遠(yuǎn)志等，屬遠(yuǎn)志科(Polygalaceae)遠(yuǎn)志屬(Polygala) 植物[1]，主要分布于我國(guó)的福建、湖南、廣西等地[2-4].‘黃花倒水蓮’是一種較為珍稀的中藥材，全草入藥，性味甘、微苦，有補(bǔ)益氣血，健脾利濕，活血調(diào)經(jīng)之功效，是瑤、苗、壯等少數(shù)民族常用的民間藥物[5].‘黃花倒水蓮’作為一種珍貴的藥材，隨著藥材市場(chǎng)對(duì)其需求的不斷增加，一再出現(xiàn)供不應(yīng)求的局面，一些地區(qū)甚至出現(xiàn)緊缺的狀況.由于其野生資源不斷被挖掘利用，已難以滿足目前的市場(chǎng)需求.‘黃花倒水蓮’以種子繁殖較多，但繁殖能力弱[6].因此要開(kāi)發(fā)及利用好‘黃花倒水蓮’這一重要資源，就必須解決其快繁問(wèn)題，而組織培養(yǎng)技術(shù)是在短期內(nèi)迅速擴(kuò)大種苗數(shù)量的最有效方法.有關(guān)‘黃花倒水蓮’的離體快繁研究，僅見(jiàn)國(guó)內(nèi)有相關(guān)報(bào)道[7-9]，但在穩(wěn)定性及可重復(fù)性方面有一定的局限性.因此，建立穩(wěn)定性好，重復(fù)性高的‘黃花倒水蓮’離體快繁技術(shù)，有望實(shí)現(xiàn)‘黃花倒水蓮’優(yōu)良種質(zhì)的快速繁殖，對(duì)解決其野生資源匱乏而供不應(yīng)求的現(xiàn)狀具有重要意義.

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為‘黃花倒水蓮’當(dāng)年生帶有嫩莖的枝條，來(lái)自福建三明市清流縣.

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1材料預(yù)處理外植體在洗潔精水中漂洗3～5 min，然后用流水沖洗30 min.在清洗過(guò)程中對(duì)過(guò)長(zhǎng)或過(guò)大的枝條進(jìn)行修剪，方便后續(xù)的消毒工作.

1.2.2外植體消毒及不定芽誘導(dǎo)取上述預(yù)處理的材料，用75%酒精和0.1%的升汞進(jìn)行消毒，設(shè)置不同的消毒時(shí)間以確定適宜黃花倒水蓮的消毒方案(表1).材料經(jīng)消毒后切成長(zhǎng)約2 cm帶1-2個(gè)葉腋的莖段，豎直插于培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L中，附加30.0 g/L蔗糖，5.0 g/L瓊脂，pH 5.7(下同).試驗(yàn)共計(jì)12個(gè)處理，每個(gè)處理20瓶，每處理放置外植體4段.莖段葉腋處誘導(dǎo)出的不定芽，則用作增殖培養(yǎng)的材料.

表1　‘黃花倒水蓮’外植體消毒方案Tab.1　The disinfection scheme of P.fallax explants

1.2.3增殖培養(yǎng)截取1.2.2中誘導(dǎo)出的不定芽，約1 cm長(zhǎng)，分別以MS和WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用相同激素種類(lèi)及濃度配比設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行黃花倒水蓮增殖培養(yǎng)基的篩選.試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2.試驗(yàn)共計(jì)18個(gè)處理及1個(gè)對(duì)照，每個(gè)處理20瓶，每處理放置材料4段.

表2　‘黃花倒水蓮’增殖培養(yǎng)基方案Tab.2　The culture medium scheme ofP.fallax proliferation　(mg·L-1)

1.2.4生根培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)IBA、NAA 2種激素不同濃度與不同量的活性炭配比，添加到1/2 MS培養(yǎng)基中(表3).選取經(jīng)增殖培養(yǎng)的健壯試管苗，切取頂芽長(zhǎng)約2 cm接入培養(yǎng)基中.試驗(yàn)共計(jì)9個(gè)處理及1個(gè)對(duì)照，每個(gè)處理20瓶，每處理放置材料4段.

1.2.5煉苗移栽以紅壤、腐殖土和珍珠巖為原料，配置6種不同的基質(zhì)，其配比設(shè)計(jì)如表4.將生根良好，生長(zhǎng)健壯的試管苗從組織培養(yǎng)室移至普通實(shí)驗(yàn)室或溫室大棚，瓶?jī)?nèi)煉苗5d，然后將瓶蓋揭開(kāi)1/3的開(kāi)度，煉苗2 d，最后將瓶蓋完全揭開(kāi)，煉苗1 d后，將組培苗從組培瓶中移栽至基質(zhì)中，并用小拱棚覆蓋.煉苗過(guò)程中，要保證基質(zhì)足夠的水分，并采取一定的遮光措施.

表3　黃花倒水蓮生根培養(yǎng)基方案Tab.3　The culture medium scheme of P.fallax rooting

表4　黃花倒水蓮移栽基質(zhì)方案Tab.4　The matrix scheme of P.fallax transplanting

1.2.6培養(yǎng)條件上述室內(nèi)培養(yǎng)，均是在溫度25 ℃，光照強(qiáng)度1 200 lx，光照周期12 h/d的條件下進(jìn)行的.

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2　結(jié)果與分析

2.1外植體消毒結(jié)果

‘黃花倒水蓮’經(jīng)不同消毒處理后，結(jié)果見(jiàn)表5.在12種處理中，污染率最高的是處理1，污染率為45.71%，污染率最低的是處理8，污染率為2.47%.消毒時(shí)間處理7-10之間無(wú)顯著差異，污染率均較低(分別為3.15%、2.47%、2.66%及3.52%).說(shuō)明在這4種消毒條件下，均可獲得良好的消毒效果.但處理7中，外植體生長(zhǎng)情況較處理8-10均要好.因此認(rèn)為，處理7(75%酒精10 s，0.1%升汞15 min)為‘黃花倒水蓮’外植體消毒的最理想方法.初代培養(yǎng)15 d左右，葉腋處可誘導(dǎo)出不定芽，在30 d后即可長(zhǎng)至2～3 cm高(圖1).

表5　不同消毒處理效果比較Tab.5　The effect compare of different disinfection treatment

表中同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05).

圖1　‘黃花倒水蓮’腋芽誘導(dǎo)Fig.1　Axillary buds induce of P.fallax

2.2增殖培養(yǎng)結(jié)果

在不同的增殖培養(yǎng)基中，‘黃花倒水蓮’不定芽的增殖效果如表6，未添加激素的對(duì)照中增殖系數(shù)最低，分別為2.08和1.89，說(shuō)明外源激素的加入可以明顯提高‘黃花倒水蓮’的增殖系數(shù).在添加了外源激素的處理中，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中處理4的增殖系數(shù)最高為5.50，且與其他各處理均有顯著差異.處理11的增殖系數(shù)最低為2.29；以WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中處理6的增殖系數(shù)最高為4.13，且與其他各處理均有顯著差異.處理10的增殖系數(shù)最低為1.39.因此，‘黃花倒水蓮’不定芽最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L(圖2).

表6　不同培養(yǎng)基對(duì)‘黃花倒水蓮’不定芽增殖的影響Tab.6　The influence on adventitious buds proliferation of P.fallax in different culture medium

表中同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05).

圖2　‘黃花倒水蓮’增殖培養(yǎng)Fig.2　P.fallax proliferation culture

2.3生根培養(yǎng)結(jié)果

不同的生根培養(yǎng)條件下‘黃花倒水蓮’的生根效果不同(表7).生根率最低處理為未添加任何激素的對(duì)照組CK，為21.0%，其余1-9處理試驗(yàn)中的生根率均在50.0%以上，說(shuō)明外源激素的加入有利于‘黃花倒水蓮’生根.生根率最高為處理4，達(dá)96.0%，且生根條數(shù)和根長(zhǎng)也在所有處理中最高.綜合分析認(rèn)為，處理4(1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+ NAA 0.3 mg/L+0.2 g/L活性炭)為‘黃花倒水蓮’的最佳生根培養(yǎng)基(圖3).

表7　不同培養(yǎng)基對(duì)‘黃花倒水蓮’生根的影響Tab.7　The influence on P.fallax rooting in different culture medium

表中同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05).

圖3　‘黃花倒水蓮’生根培養(yǎng)Fig.3　P.fallax rooting culture

2.4煉苗移栽結(jié)果

由表8可知，不同的移栽基質(zhì)對(duì)‘黃花倒水蓮’的生根率有顯著差異，成活率最低的是處理1，成活率僅為66.7%，在處理6的基質(zhì)中，‘黃花倒水蓮’試管苗的成活率最高為95.2%，且與處理4和處理5之間差異不顯著(分別為94.5%和94.9%)，所以，這3個(gè)處理的基質(zhì)均適宜‘黃花倒水蓮’的移栽煉苗.但從管理和基質(zhì)成本來(lái)看，添加一定比例的紅壤有助于提高基質(zhì)的保水性，減少補(bǔ)水次數(shù)，還可以降低基質(zhì)的成本.因此，實(shí)際生產(chǎn)栽培過(guò)程中建議使用處理4的紅壤∶腐殖土∶珍珠巖=1∶1∶1基質(zhì)配比，成活率達(dá)94.5%(圖4).

表8　不同基質(zhì)對(duì)黃花倒水蓮煉苗的影響Tab.8　The influence on P.fallax seedlling exercising in different matrix

表中同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05).

圖4　‘黃花倒水蓮’移栽煉苗Fig.4　P.fallax Hemsl transplanting and exercising

3　討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基適合‘黃花倒水蓮’外植體腋芽誘導(dǎo)，羅萬(wàn)業(yè)等[8]，李翠蘭等[9]在建立‘黃花倒水蓮’離體快繁技術(shù)體系時(shí)，也選用了同樣的培養(yǎng)基.而劉秀芳等[7]則以1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加與本試驗(yàn)相同的激素種類(lèi)和配比，對(duì)黃花倒水蓮莖段進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，也取得了較理想的效果.MS是一種元素間平衡較好，緩沖能力強(qiáng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基[10]，1/2 MS只是將大量元素減半.在腋芽誘導(dǎo)初期，外植體內(nèi)本身貯存著一定量的能量及營(yíng)養(yǎng)，甚至這些能量及營(yíng)養(yǎng)足夠或超出誘導(dǎo)腋芽之所需，因此，此類(lèi)基礎(chǔ)培養(yǎng)的選擇對(duì)腋芽的誘導(dǎo)影響并不大.另外，培養(yǎng)時(shí)的條件及取材的基因型不同也會(huì)有一定的影響.

增殖培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著6-BA濃度的增高，不論是以MS還是經(jīng)以WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)方案中，不定芽的增殖系數(shù)均呈上升趨勢(shì).但以1.5 mg/L時(shí)最為適宜，超過(guò)則增殖系數(shù)開(kāi)始下降，且出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象.這與劉秀芳等[7]的研究結(jié)果以及在對(duì)同屬植物晉產(chǎn)遠(yuǎn)志進(jìn)行增殖試驗(yàn)時(shí)獲得的結(jié)果相一致[11].一般情下，TDZ的作用強(qiáng)度要大于6-BA.而試驗(yàn)結(jié)果表明，在2種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.01、0.03、0.05 mg/L的TDZ，其增殖效果顯著不如6-BA的效果.這可能與所添加的TDZ的濃度較低有關(guān).

在生根培養(yǎng)時(shí)，添加合理濃度范圍的生長(zhǎng)素有利用‘黃花倒水蓮’芽苗的生根.但是不論任何一種激素配比的培養(yǎng)基，均會(huì)產(chǎn)生一定量的愈傷組織.而且這種情況會(huì)隨著生長(zhǎng)素濃度的提高而加劇.試驗(yàn)過(guò)程中，往往在高生根率的同時(shí)伴隨著較多愈傷組織的產(chǎn)生.‘黃花倒水蓮’生根培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，在生根培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，能較好地抑制愈傷組織的形成，在后期煉苗時(shí)，其根不易斷開(kāi)，有利于提高移栽煉苗時(shí)的成活率.這與李翠蘭等[9]的研究結(jié)果相一致.

已有報(bào)道認(rèn)為，泥炭土∶黃泥土∶珍珠巖=2∶1∶1是較適合黃花倒水蓮的煉苗基質(zhì)，移栽成活率可達(dá)92.6%[7].本試驗(yàn)結(jié)果顯示，紅壤∶腐殖土∶珍珠巖=1∶1∶1、腐殖土∶珍珠巖=1∶1、全腐殖土3種基質(zhì)組合的成活率均高于94%.然而，在全紅壤的基質(zhì)中，移栽數(shù)天后，苗木根部變黑并逐漸腐爛，最終大量死亡.推測(cè)是基質(zhì)透氣性太差，導(dǎo)致根部無(wú)氧呼吸產(chǎn)生酒精，繼而造成根部毒害.較多研究表明，試管苗移栽成活率與基質(zhì)本身的保水、保肥、透氣性和自身穩(wěn)定性密切相關(guān).因此，要求煉苗基質(zhì)要疏松透氣，并具有一定的持水力[12-15].

[1]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1997,43(3):151-152

[2]陳書(shū)坤.中國(guó)遠(yuǎn)志屬植物的分類(lèi)研究[J].植物分類(lèi)學(xué)報(bào),1991,29(3):193-229

[3]劉賢銘,王鐵僧,姚淦.江浙閩臺(tái)地區(qū)遠(yuǎn)志類(lèi)藥用植物資源整理及鑒定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2006,17(20):243

[4]張培軒,段瑞,黃鵬.中國(guó)遠(yuǎn)志屬藥用植物資源及地理分布[J].基層中藥雜志,2002,16(6):42-43

[5]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大詞典·下冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)出版社,1986

[6]張杭穎,鄭可利,卓翠藍(lán),等.藥用植物黃花倒水蓮研究進(jìn)展[J].三明學(xué)院學(xué)報(bào),2008,25(2):197-203

[7]劉秀芳,林文革,蘇明華,等.黃花倒水蓮(PolygalafallaxHemsl)組培快繁技術(shù)研究[J].種子,2012,31(2):57-59,63

[8]羅萬(wàn)業(yè),魏錦秋,蔡梅玲,等.黃花倒水蓮組培快繁育苗技術(shù)研究[J].農(nóng)技服務(wù),2012,29(12):1335-1336

[9]李翠蘭,蘇鈺琴,莫燕蘭,等.黃花倒水蓮組織培養(yǎng)體系的建立研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2012(13):77,79

[10]鞏振輝,申書(shū)興.植物組織培養(yǎng)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007

[11]胡侃.晉產(chǎn)遠(yuǎn)志種子萌發(fā)、組織培養(yǎng)及根顯微結(jié)構(gòu)研究[D].太原:山西大學(xué),2008

[12]辛培堯,劉巖,李根前,等.滇楊組培苗的移栽技術(shù)研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012,32(2):23-25

[13]戴彩虹,馬紹英,李勝，等.山葡萄‘雙紅’和‘雙優(yōu)’的試管快繁研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,49(4):63-68,72

[14]唐軍榮,鄭元,張亞威,等.無(wú)籽刺梨離體快繁技術(shù)研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2015,30(1):70-75

[15]馬彥軍,程艷青,張榮梅.黑果枸杞組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J].林業(yè)科技通訊,2015(6):26-28

(責(zé)任編輯李辛)

The technology researchinvitrorapid propagation ofPolygalafallaxHemsl

LI Bin,FEI Xi-tong,TANG Jun-rong, YIN Li-sha, HAN Guo-wei,XIN Pei-yao

(Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest Region of China, State Forestry Administration,Southwest Forestry University,Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

【Objective】 Technological systeminvitrorapid propagation ofPolygalafallaxHemsl was studied and established.【Method】 After disinfecting with different methods, the tender stems ofP.fallaxused as explant were inoculated in culture medium of MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L to induce the adventitious buds.Then adventitious buds were inoculated in different culture medium with different kind and concentration exogenous hormonesto to culture.The suitalble proliferation and rooting culture medium ofP.fallaxwere selected by the condition of proliferation and rooting. The rooting seedllings ofP.fallaxwere planted in different matrix to selected the suitable exercising matrix by statistic of survival rate. 【Result】 Better sterilization effect was obtained by the method of disinfected with 75% alcohol for 10 s and 0.1% mercuric chloride for 15 min . The contamination rate was as low as 3.15%. MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L was suitable forP.fallaxproliferation culture, the proliferation confficient was 5.50；1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+0.2 g/L activated carbon was suitable forP.fallaxrooting culture. The rooting rate was 96%; The best exercising matrix ofP.fallaxvitro seedlling is laterite∶ humus∶ perlite = 1∶1∶1, the survival rate is 94.5%. 【Conclusion】 The vitro rapid propagation ofP.fallaxwas established triumphantly.

PolygalafallaxHemsl;rapid propagation;technology

李斌(1988-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榱帜具z傳育種與快繁.E-mail：445118715@qq.com

辛培堯，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事林木遺傳育種與快繁研究.E-mail：xpytgyx@163.com

西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(YNGB201503)；云南省林學(xué)一級(jí)學(xué)科博士點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目.

2016-03-31；

2016-04-18

Q 943.1

A

1003-4315(2016)04-0037-06