李　軍，劉　麗，范　穎

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧　沈陽(yáng)　110847)

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HPLC法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)中益氣丸中阿魏酸、橙皮苷和甘草酸的含量

李軍，劉麗，范穎

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110847)

建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)中益氣丸中阿魏酸、橙皮苷和甘草酸的含量。采用Agilent ZORBAX SBC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-0.05% 磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：340 nm；柱溫：30 ℃。結(jié)果顯示，阿魏酸的進(jìn)樣量在0.064～1.6 μg 范圍內(nèi)(r=0.9992)、橙皮苷的進(jìn)樣量在1.6～40 μg范圍內(nèi)(r=0.9997)、甘草酸的進(jìn)樣量在1.6～40 μg范圍內(nèi)(r=0.9992)線性關(guān)系良好，阿魏酸、橙皮苷和甘草酸的平均回收率分別為99.90% (RSD=2.07%，n=6)、101.25% (RSD=1.40%，n=6)和100.89% (RSD=2.20%，n=6)。該方法簡(jiǎn)便快捷，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于補(bǔ)中益氣丸的質(zhì)量控制。

補(bǔ)中益氣丸；HPLC；含量測(cè)定

補(bǔ)中益氣丸是中醫(yī)臨床治療中常用的補(bǔ)益藥，其原方“補(bǔ)中益氣湯”出自于金元時(shí)期著名的醫(yī)家李東垣基于臨床實(shí)踐和中醫(yī)理論所著的《脾胃論》，具有補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)舉陷的功效，主治脾胃氣虛所致的發(fā)熱自汗、體倦肢軟、面色晄白、大便稀溏以及氣虛下陷所致的脫肛、子宮下垂、久痢、久瀉等病癥。該方劑是由炙黃芪、炙甘草、陳皮、柴胡、當(dāng)歸、黨參、升麻、炒白術(shù)八味藥材加工而成[1-4]。2015 年版《中國(guó)藥典》中對(duì)于補(bǔ)中益氣丸的相關(guān)制劑(包括補(bǔ)中益氣丸、補(bǔ)中益氣丸水丸，補(bǔ)中益氣合劑)的質(zhì)量控制僅規(guī)定檢測(cè)黃芪甲苷的含量，但是對(duì)于其他藥物的成分卻沒(méi)有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)[5-8]。然而，鑒于中藥復(fù)方藥物所含化學(xué)成分的復(fù)雜性，有必要建立能夠同時(shí)測(cè)定多種指標(biāo)成分含量的分析方法。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定了市售的補(bǔ)中益氣丸中阿魏酸、橙皮苷和甘草酸的含量，此方法的建立為其相應(yīng)藥物制劑的質(zhì)量控制提供了有效依據(jù)。

1　儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀，二元泵系統(tǒng)，SPD-M20A紫外檢測(cè)器，日本島津；SIMS50000 超純凈水器，美國(guó)MILLI-Q；KQ-5200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；TD-25電子分析天平，美國(guó)丹佛儀器有限公司；鼓風(fēng)恒溫干燥箱，上海精宏儀器設(shè)備有限公司。

阿魏酸對(duì)照品(批號(hào): 110773-201309)，橙皮苷對(duì)照品(批號(hào): 110721-201211)，甘草酸對(duì)照品(批號(hào): 110731-201201)，以上3種對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物檢定所；被測(cè)樣品均為市售的補(bǔ)中益氣丸；甲醇和乙腈，色譜純，美國(guó)Fisher公司生產(chǎn)；去離子水，美國(guó)MILLI-Q SIMS50000超純凈水器制備；磷酸，分析純，天津博迪化工有限公司生產(chǎn)。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SBC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A(乙腈)-B(0.05%磷酸水溶液)梯度洗脫；波長(zhǎng)：340 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相梯度程序如表1所示。

表1　流動(dòng)相梯度程序

2.2對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取阿魏酸、橙皮苷和甘草酸各0.68 mg、16.00 mg和16.00 mg，加入甲醇溶解后并定容至50 mL 的容量瓶中，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為0.0128 mg/mL、0.32 mg/mL和0.32 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

2.3供試品溶液制備

取補(bǔ)中益氣丸40丸，研細(xì)，混勻，精密稱取1 g細(xì)粉置于具塞磨口三角燒瓶?jī)?nèi)，精密加入20 mL甲醇，稱定重量并記錄后，超聲處理(功率為250 W，頻率為40 kHz)30 min后，取出放至室溫，再次稱重，用甲醇補(bǔ)充減少的重量，搖勻后過(guò)濾，將濾液減壓干燥，殘?jiān)蛹状既芙猓⑥D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶?jī)?nèi)，加甲醇至刻度線，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4陰性對(duì)照溶液的制備

圖1　HPLC色譜圖

根據(jù)補(bǔ)中益氣丸處方比例和工藝制備不含炙甘草、陳皮、當(dāng)歸的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液分別進(jìn)樣20 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并記錄色譜圖，結(jié)果顯示陰性無(wú)干擾(見(jiàn)圖1)。

2.5線性關(guān)系的考察

分別精密量取混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件注入HPLC測(cè)定峰面積值，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得3種成分的回歸方程：Y=2×106X-39516，r=0.9992，表明阿魏酸在0.064～1.6 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系；Y=1×106X+16227，r=0.9997，表明橙皮苷在1.6～40 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系；Y=413615X+5042，r=0.9992，表明甘草酸在1.6～40 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.6精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。阿魏酸、橙皮苷和甘草酸峰面積的RSD值為1.85%、1.67%和1.97%，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)儀器精密度良好(見(jiàn)表2)。

表2　精密度測(cè)定結(jié)果

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次的補(bǔ)中益氣丸供試品(批號(hào)：1408007002)溶液分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣20 μL測(cè)定峰面積，結(jié)果阿魏酸、橙皮苷和甘草酸峰面積的RSD值為0.87%、1.34%和1.16%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定(見(jiàn)表3)。

表3　穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

續(xù)表3

81247611212420424124075橙皮苷0375044238118743839271.34638559683750081238140724389502甘草酸0227741222475742251831.16622643682301501223025124231414

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的補(bǔ)中益氣丸樣品(批號(hào)：1408007002)，按“2.2”項(xiàng)下方法平行處理，制備供試品溶液6份，按上述“2.1”項(xiàng)下色譜條件吸取供試品溶液各20 μL，注入HPLC進(jìn)行分析。阿魏酸、橙皮苷和甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別為2.51%、1.77%和2.62%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

取含量已知的補(bǔ)中益氣丸樣品6份(批號(hào)：1408007002)，粉碎，分別取1.0 g，精密稱定，置于具塞三角燒瓶?jī)?nèi)，分別加入阿魏酸、橙皮苷和甘草酸對(duì)照品適量，按上述“2.2”項(xiàng)方法處理，制備供試品溶液。測(cè)得阿魏酸的平均回收率為99.90%(n=6)，RSD=2.07%；橙皮苷的平均回收率為101.25%(n=6)，RSD=1.40%；甘草酸的平均回收率為100.89%(n=6)，RSD=2.20%，見(jiàn)表4。

表4　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10樣品的測(cè)定

表5　樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=6)

取6批補(bǔ)中益氣丸樣品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，分別計(jì)算阿魏酸、橙皮苷和甘草酸的含量。見(jiàn)表5。

3　討　論

3.1提取方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了采用甲醇加熱回流和超聲的提取方式，并比較不同的提取時(shí)間(10，15，30，45，60 min)。結(jié)果表明，以甲醇超聲提取30 min為提取效果最優(yōu)。

3.2流動(dòng)相系統(tǒng)選擇

本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.05%磷

酸、乙腈-水的等度和梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相的酸堿度對(duì)補(bǔ)中益氣丸所含成分的分離有一定影響，結(jié)果采用乙腈-0.05%磷酸梯度洗脫使得三種指標(biāo)性成分與雜質(zhì)達(dá)到較好的分離效果且峰形較好。但是，由于補(bǔ)中益氣丸的藥味較多、成分復(fù)雜，各物質(zhì)在普通HPLC色譜柱上實(shí)現(xiàn)良好的分離度通常會(huì)需要較長(zhǎng)的保留時(shí)間，因此，建議通過(guò)UPLC色譜柱更強(qiáng)的分離能力來(lái)開(kāi)發(fā)用時(shí)更短的分析條件。

4　結(jié)　論

該實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)中益氣丸中阿魏酸、橙皮苷和甘草酸的含量，方法簡(jiǎn)便易行，并且在優(yōu)化的色譜條件下三種指標(biāo)性成分能達(dá)到良好的分離效果，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適用于補(bǔ)中益氣丸的相關(guān)制劑的質(zhì)量控制。

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Simultaneous Determination of Ferulic Acid, Hesperidin and Glycyrrhizic Acid in Buzhongyiqi Pills by HPLC

LI Jun, LIU Li, FAN Ying

(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Liaoning Shenyang 110847, China)

A method for the determination of ferulic acid, hesperidin and glycyrrhizic acid in Buzhongyiqi pills was established. The separation was performed on a Agilent ZORBAX SBC18 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm)with acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution as mobile phase with gradient elution at the flow rate of 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was set at 340 nm, and the column temperature was 30 ℃. The linear range of erulic acid, hesperidin and glycyrrhizic acid was 0.064～1.6 μg (r=0.9992), 1.6～40 μg (r=0.9997) and 1.6～40 μg (r=0.9992), the average recovery rates were 99.90% (RSD=2.07%，n=6), 101.25% (RSD=.40%，n=6) and 100.89% (RSD=2.20%, n=6), respectively. The established HPLC method is proved to be convenient, reproducible, precise and suitable for the content determination of Buzhongyiqi pills.

Buzhongyiqi pills; HPLC; content determination

李軍(1979-)，男，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

R917

A

1001-9677(2016)016-0139-04