付安妮，高明波, 馮　杰

(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 遼寧　大連　116600 )

?

刺梨中SOD的提取和酶活測定

付安妮，高明波, 馮杰

(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 遼寧大連116600 )

刺梨原產(chǎn)于我國西南地區(qū)，以貴州省為主，是目前發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶(SOD)含量最高的水果[1]。本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化法，分別測定刺梨鮮果、糖漬刺梨、刺梨干沖泡的飲品和刺梨酒中的SOD酶活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，刺梨鮮果和糖漬刺梨的SOD酶活分別為2140 U/g和3716.2 U/g；刺梨干沖泡的飲品、刺梨酒的SOD酶活分別是308.2 U/mL、368.1 U/mL。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，刺梨果實(shí)用糖腌制后SOD活性提高1.7倍左右，而制成飲品后SOD的酶活變化不大。

刺梨；超氧化物歧化酶；鄰苯三酚自氧化法；糖漬法

SOD(Super Oxide Dismutase)即是超氧化物歧化酶。它能專一地清除體內(nèi)的有害自由基。氧中毒、急性炎癥、水腫、自身免疫性疾病、輻射病等疾病都是由其中的氧自由基引起的，而SOD 能夠清除自由基，因此可消除上述疾病的病因，是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶。

刺梨是薔薇屬的野生灌木植物，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、延緩衰老、抗癌等功能[1-2]。刺梨果實(shí)中含有豐富的超氧化物歧化酶(SOD)、維生素、微量元素、五環(huán)三萜、黃酮、有機(jī)酸、氨基酸和無機(jī)鹽等化學(xué)成分。最值得注意的是：刺梨是目前發(fā)現(xiàn)的SOD含量最高的水果，至今未被超越[1]。與其它果蔬SOD含量的對比如表1所示[3]。

但是這一綠色資源至今仍廣泛地被埋沒于于山區(qū)中，沒有得到很好的開發(fā)利用，一個(gè)主要原因是刺梨產(chǎn)期較短(只有30天左右)，不耐貯藏。目前人們常用以下三種保藏方式：曬干、釀酒和糖腌制。獲得的刺梨干果(泡茶飲用)、刺梨酒和糖漬刺梨可以長期保存，全年食用。所以本實(shí)驗(yàn)，將刺梨按如上方法處理，檢測刺梨干沖泡飲品、刺梨酒和糖漬刺梨的SOD酶活，并分析比較三種保藏方式對酶活的影響，提出關(guān)于刺梨食用方式的一些建議。

表1　刺梨與常見果蔬的SOD含量對比

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1材料與試劑

刺梨鮮果：2015年9月于貴州當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I的野生刺梨鮮果；挑選出體型較大、肉刺分布均勻、較硬的果實(shí)若干，用去離子水清洗備用。

1 U/5 μL標(biāo)準(zhǔn)SOD液: SOD標(biāo)準(zhǔn)品(5673 U/mg)購于中國藥品生物制品檢定所；取1.6 mg SOD標(biāo)準(zhǔn)品定容至45.384 mL去離子水中，4 ℃冰箱中備用。

其他試劑為分析純，購買于科密歐化學(xué)公司。

1.2主要儀器

UV-5200紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；S10H中藥超聲萃取儀，Elma-Hans；ABS 80-4電子分析天平，KERN & Sohn GmbH；FZ102型微型植物試樣粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干箱，昆山市超聲波儀器有限公司；H-2050R臺式高速冷凍離心，長沙湘儀離心機(jī)有限公司。

1.3刺梨SOD提取和檢測方法

1.3.1SOD的提取方法

1.3.1.1果肉中SOD的提取

刺梨鮮果處理：取適量果實(shí)切片后備用。

糖漬刺梨處理：刺梨鮮果切片，置于玻璃器皿內(nèi)均勻鋪開，按m刺梨:m白砂糖=1:2的比例撒上白砂糖，密封后靜置一個(gè)禮拜。

SOD提?。喝∵m量刺梨鮮果/糖漬刺梨于A4紙上均勻鋪開，置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，55 ℃[4-5]干燥2 h，之后用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，分別稱量20 g待用。按1:4的比例加入磷酸緩沖液80 mL，置于中藥超聲萃取儀中，4 ℃超聲30 min[6]，之后在4 ℃條件下，10000 r/min離心20 min，得到的上清液即為SOD粗酶液，測量并記錄粗酶液的體積，于4 ℃冰箱中保藏備用。

1.3.1.2飲品的獲取

刺梨酒：刺梨鮮果切片，于蒸鍋內(nèi)加熱5 min左右，放入密封罐內(nèi)，并加入56度白酒加以浸泡，密封罐子并靜置?，F(xiàn)有兩種家釀刺梨酒，分別編號為A(浸泡開始后未做任何處理，成品酒呈深棕色)和B(浸泡過程中多次加水，導(dǎo)致成品酒呈淺棕色)。浸泡時(shí)間均為1年左右。

刺梨干沖泡飲品：取三片曬干刺梨切片，置于250 mL玻璃杯中，加入200 mL左右沸水，沸水從無色變成棕色后即可飲用。

分別取5 mL的刺梨酒A/B及沖泡飲品備用。

1.3.2SOD酶活檢測方法

鄰苯三酚(PR)自氧化法是目前應(yīng)用最廣泛的測試方法。所用試劑和儀器普通，測試方便且靈敏度高[7]。通過制備標(biāo)準(zhǔn)SOD終濃度對鄰苯三酚(PR)自氧化抑制率的回歸方程，再測得刺梨樣液對PR的抑制率，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程及樣液的稀釋倍數(shù)計(jì)算出刺梨樣品SOD的活力。根據(jù)文獻(xiàn)確定實(shí)驗(yàn)條件為：系統(tǒng)PR濃度 60 mmol/L[7]；系統(tǒng)pH=8.2±0.01；孵育溫度25 ℃下測量320 nm吸光光度值。

此外刺梨富含黃酮類化合物，該類化合物在紫外區(qū)有強(qiáng)吸收，會干擾鄰苯三酚法對SOD活性的測定結(jié)果，故在測定每一濃度的試液的吸光度時(shí)均需加測本底吸收值，以校正測定結(jié)果。本底值即用10 mmol/L HCL代替PR進(jìn)行檢測，得到的吸光度值。相關(guān)公式如下：

(1)

(2)

(3)

式中：A0——PR自氧化至4 min時(shí)反應(yīng)液在320 nm處的吸收值

As——SOD標(biāo)準(zhǔn)品抑制PR自氧化至4 min時(shí)反應(yīng)液在320 nm處吸收值

Aa——刺梨SOD樣液抑制PR自氧化至4 min 時(shí)反應(yīng)液在320 nm處的吸收值

Ab——刺梨SOD樣液在320 nm處的本底吸收值

Y——標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算出的樣品在反應(yīng)樣液中的 SOD的濃度，U/mL

4——反應(yīng)樣液總體積，mL

V0——刺梨樣品SOD提取液體積，mL

VS——測定用SOD提取液體積，μL

m——刺梨樣品質(zhì)量，g

1.3.2.1PR自氧化速率

于試管中加入4 mL緩沖液，25 ℃保溫10 min，加入同樣溫度孵育的PR 20 μL，快速搖勻后立即計(jì)時(shí)。以Tris-HCl緩沖液為空白對照，于320 nm波長下每1分鐘測一次吸光度，共計(jì)6 min。計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度A的增值，得到PR自氧化速率ΔA=0.06(A/min)。

1.3.2.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

編號1～6的試管中均加入4 mL緩沖液，再分別加入5、10、15、20、25、30 μL的1 U/5 μL SOD標(biāo)準(zhǔn)溶液，25 ℃水浴保溫10 min后分別加入同樣溫度孵育的PR 20 μL，快速搖勻后立即計(jì)時(shí)，記錄4 min時(shí)混合溶液在320 nm處的吸收值，按公式(1)計(jì)算抑制率，得到標(biāo)準(zhǔn)方程，做出回歸曲線。

1.3.2.3刺梨果肉及飲品的SOD活性測定

用刺梨鮮果/糖漬刺梨提取液及刺梨酒A/B及沖泡飲品替代SOD標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟，并加測本底吸收值，以排除黃酮類物質(zhì)的干擾。根據(jù)數(shù)據(jù)盡量調(diào)整其抑制率接近50%，按公式(3)計(jì)算樣品SOD活性，在樣品SOD活性的測定中嚴(yán)格以SOD標(biāo)準(zhǔn)試劑加以對照。

2　結(jié)　果

2.1自氧化速率

實(shí)驗(yàn)測量320 nm下反應(yīng)液吸光度，計(jì)算得到PR自氧化速率為0.60，結(jié)果如表2所示。

表2　鄰苯三酚(PR)自氧化速率

2.2標(biāo)準(zhǔn)方程

取4 min時(shí)PR測得的吸光度0.296代入公式(2)，算出標(biāo)準(zhǔn)SOD對鄰苯三酚的抑制率，以SOD終濃度值(U/mL)作為橫坐標(biāo)，抑制率(%)作為縱坐標(biāo)制得標(biāo)準(zhǔn)方程Y=24.7490X+5.2252，結(jié)果如表3所示。

表3　標(biāo)準(zhǔn)SOD終濃度與PR自氧化抑制率之間的關(guān)系

2.3回歸曲線

以SOD標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，SOD標(biāo)準(zhǔn)品對PR的抑制率為縱坐標(biāo)，作出回歸曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)SOD濃度與PR自氧化抑制率間的回歸曲線

2.4刺梨果肉及飲品SOD檢測結(jié)果

測得刺梨鮮果樣品在320 nm下的吸光度，并代入公式(3)計(jì)算出反應(yīng)液的抑制率，結(jié)果如表4所示。

表4　刺梨鮮果SOD提取液測量結(jié)果

取抑制率最為接近50%的第四組數(shù)據(jù)，加入刺梨樣液20 μL時(shí)抑制率為58.11%，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程算出刺梨鮮果樣液的SOD濃度為2.14 U/mL，代入公式(3)算出刺梨SOD酶活為2140 U/g。采用相同的方法，測量糖漬刺梨果肉中的SOD酶活，結(jié)果為3716.2 U/g。

針對飲品類刺梨SOD提取液，以U/mL為統(tǒng)一的酶活計(jì)量單位，計(jì)算出剩下刺梨制品的SOD酶活，結(jié)果如表5所示。

表5　刺梨酶活

3　討　論

通過對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的整理分析發(fā)現(xiàn)，采用白砂糖腌制的方法可以提高刺梨果肉中的SOD酶活，提高到1.7倍左右。同時(shí)，還能延長果肉的保存時(shí)間。

刺梨飲品中，刺梨酒和干果沖泡飲品的SOD酶活變化不大，刺梨酒酶活僅提高了17.4%?？梢姏_泡的方式對酶活的影響不大，兩種方式皆可使用。

本次實(shí)驗(yàn)中，還加測了一組刺梨酒B，制作者在浸泡過程中曾多次取出部分刺梨酒飲用，其后又加入近似體積的水。試驗(yàn)測得這組樣品的SOD酶活為80.4 U/mL，對PR的抑制率為20%。比較發(fā)現(xiàn)酒B的SOD酶活僅為酒A的1/5，因此不建議在刺梨酒釀造過程中加水稀釋，會大大降低SOD的酶活。

建議：選擇刺梨果肉部分食用時(shí)，建議采用糖漬的方式腌制，處理后果肉的SOD酶活明顯提高，而且保存時(shí)間長，可全年食用。同時(shí)糖漬法簡單快捷，腌制時(shí)間短，所以十分推薦此方法。而刺梨飲品中，SOD酶活變化不大，且兩種方式保存時(shí)間也很接近，根據(jù)喜好選擇即可。

刺梨多為野生，成本低，其產(chǎn)品符合現(xiàn)代食品營養(yǎng)保健及綠色有機(jī)的要求，建議進(jìn)一步開發(fā)利用。

[1]黎放. 抗癌珍果“SOD刺梨”[J]. 技術(shù)與市場, 2010, 17(5):125-125.

[2]何照范,熊綠蕓,吳立夫.剌梨——其營養(yǎng)、防癌與抗衰老作用[J].生命的化學(xué):中國生物化學(xué)會通訊, 1988(3):51-52.

[3]史肖白,顧姻,莊一義,等. 刺梨超氧化物歧化酶含量的分析研究[A]. 中國園藝學(xué)會.中國園藝學(xué)會成立70周年紀(jì)念優(yōu)秀論文選編[C].中國園藝學(xué)會,1999:4.

[4]李蘭, 郭丹釗, 孟慶陽. 刺梨細(xì)胞中SOD的幾種提取方法研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2006(2):71-73.

[5]魏瑞鋒, 魏桃英. 獼猴桃中SOD提取工藝研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013(32):12716-12717.

[6]王振偉, 許鐳. 超聲波輔助提取刺梨中SOD的工藝研究[J]. 黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào), 2015, 27(1):46-49.

[7]韓少華,朱靖博,王妍妍. 鄰苯三酚自氧化法測定抗氧化活性的方法研究[J]. 中國釀造, 2009(6):155-157.

[8]宋金耀.超氧化物歧化酶-鄰苯三酚自氧化測活方法的改進(jìn)[J].河北農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào),1992,6(2):30-35.

[9]吳素玲,張衛(wèi)明,孫曉明,等. 刺梨SOD活力測定研究[J]. 食品科學(xué), 2005,26(11):58-62.

Extraction and Activity Determination of SOD in Rosa roxburghii Tratt

FU An-ni, GAO Ming-bo, FENG Jie

(College of Life Science, Dalian Nationalities University, Liaoning Dalian 116600, China)

RosaroxburghiiTrattis a kind of fruit native to southwest of China, mainly in Guizhou province. Its super oxide dismutase (SOD) content is the highest among fruits. Pyrogallol autoxidation method was used to determine the SOD activity of fresh fruits and candied fruits, drinks and wine. The results showed that the SOD activity of fresh fruits and candied fruits were 2140 U/g and 3716.2 U/g, respectively. The SOD activity of drinks and wine were 308.2 U/mL and 368.1 U/mL, respectively. It could be found that the SOD activity of the sugared fruits was 1.7 times that of the fresh fruits, while the SOD activity of the drinks and wine were similar.

RosaroxburghiiTratt；SOD(Super Oxide Dismutase)；Pyrogallol autoxidation method；sugaring treatment

付安妮(1993-)，女，大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

高明波(1974-)，女，副教授，主要從事藥用植物方面的研究。

Q946.5

A

1001-9677(2016)016-0144-03