何　瓊，王家寧，干艷捷，王元媛，張傳林

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院心臟中心，湖北 十堰　442000)

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茜草素激活Wistar大鼠腎葉間動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道

何瓊，王家寧，干艷捷，王元媛，張傳林

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院心臟中心，湖北 十堰442000)

目的研究茜草素對(duì)大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large conductance calcium activated potassium channels,BKCa)的調(diào)節(jié)作用。方法在快速分離的Wistar大鼠腎葉間動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)研究茜草素對(duì)BKCa介導(dǎo)的外向電流的調(diào)節(jié)情況。結(jié)果BKCa特異性抑制劑伊比利亞毒素(ibTX)抑制茜草素的增強(qiáng)作用(P<0.01)；去除細(xì)胞外液中的鈣離子，L-鈣通道抑制劑尼莫地平(nimodipine)、鈣離子螯合劑BAPTA-AM和ryanodine均能抑制茜草素對(duì)腎葉間動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞外向電流的增強(qiáng)作用(P<0.05)。結(jié)論茜草素通過(guò)激活L-鈣通道，促進(jìn)鈣離子由細(xì)胞膜外進(jìn)入胞質(zhì)，內(nèi)流的鈣離子進(jìn)一步激活ryanodine受體，引起胞質(zhì)中鈣離子濃度快速升高，激活平滑肌細(xì)胞膜BKCa通道。

茜草素；膜片鉗；腎葉間動(dòng)脈；BKCa通道；鈣離子；平滑肌

在腎葉間動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上的BKCa激活后，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流，導(dǎo)致細(xì)胞膜電位超極化，引起血管擴(kuò)張[1]。但是高血壓狀態(tài)下，動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜BKCa功能和表達(dá)障礙致其介導(dǎo)的舒張血管功能減弱[2]，導(dǎo)致肌源緊張性高血壓的產(chǎn)生[3]。中藥茜草是治療高血壓的重要中藥材之一，研究發(fā)現(xiàn)茜草提純后的有效成分是1-2-二羥基-9-10-蒽二酮[4]，但是含有1-2-二羥基-9-10-蒽二酮的番瀉葉可以激活L型鈣離子通道，導(dǎo)致鈣離子由細(xì)胞膜外進(jìn)入胞質(zhì)[5]。在平滑肌細(xì)胞中，鈣離子內(nèi)流可導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞去極化，引起動(dòng)脈血管收縮，這與茜草在中醫(yī)臨床治療高血壓相矛盾[6]。但是細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化是BKCa激活的重要條件。因此我們應(yīng)用膜片鉗技術(shù)研究茜草素對(duì)大鼠腎葉間動(dòng)脈及其平滑肌細(xì)胞BKCa介導(dǎo)的外向電流的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證編號(hào)SCXK京2007-0001)，動(dòng)物質(zhì)量符合清潔級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)，10～12周齡，♀♂不拘，體質(zhì)量(283.0±21.2)g。

1.2試驗(yàn)藥物及主要試劑茜草素批號(hào)及規(guī)格：122777-100 g；使用二甲基亞砜(DMSO)將茜草素配置為10-2mol·L-1的母液，再使用預(yù)先配置的PSS液體稀釋。二甲基亞砜(DMSO)批號(hào)及規(guī)格：D2650-100 mL。BAPTA-AM批號(hào)及規(guī)格:A1076-25 mg；Ryanodine批號(hào)及規(guī)格:R128-25 mg；伊比利亞毒素(ibTX)批號(hào)及規(guī)格：15904-100 μg；均使用預(yù)先配置的PSS液體溶解。以上藥物均購(gòu)自Sigma公司。配置PSS液體使用的試驗(yàn)試劑均是國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭咝б合嗌V法(HPLC)分析純度不小于97%，(2～8)℃保存。

1.3方法全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法參照王洋等[7]及李新芝等[8]方法。

2　結(jié)果

2.1ibTX抑制茜草素的增強(qiáng)作用細(xì)胞封接穩(wěn)定后孵育30 s，平滑肌細(xì)胞外向電流(60 mV)是(258.0±8.5) pA， 給予10-5mol·L-1茜草素預(yù)灌流15 s后，外向電流是(354.0±11.4) pA，預(yù)灌流10-8mol·L-1ibTX 3 min，再給予10-5mol·L-1茜草素預(yù)灌流15 s，平滑肌細(xì)胞外向電流是(122.6±5.5) pA(n=6，P<0.01)，細(xì)胞外液洗脫3 min后外向電流是(243.0±8.8) pA，見(jiàn)Fig 1。

2.2細(xì)胞膜外鈣離子介導(dǎo)茜草素增強(qiáng)腎葉間動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞外向電流將腎葉間動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在無(wú)鈣外液孵育30 min后，給予10-5mol·L-1茜草素預(yù)灌流15 s前后電流(60 mV)分別是：(65.3±9.4)pA和(64.8±8.1)pA，預(yù)灌流前后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；含有鈣離子的細(xì)胞外液茜草素預(yù)灌流15 s前后電流(60 mV)分別是：(258±8.5)pA和(354±11.4)pA(n=6，P<0.01)，見(jiàn)Fig 2。

Fig 1　ibTX inhibits alizarin mediated outward currents(n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 2　Ca2+ inhibits alizarin enhancing effect in extra-cellular fluid(n=6)

*P<0.05vscontrol

2.3尼莫地平抑制茜草素的增強(qiáng)作用預(yù)灌流尼莫地平(L-鈣通道抑制劑，10-5mol·L-1) 前后，給予茜草素(10-5mol·L-1)，腎葉間動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞外向電流(60 mV)分別是(551.0±71.0)pA和(54.1±11.0)pA (n=6，P<0.01)，見(jiàn)Fig 3。

2.4細(xì)胞內(nèi)鈣離子介導(dǎo)茜草素增強(qiáng)的外向電流將BAPTA-AM(鈣離子螯合劑，20 μmol·L-1) 加入電極內(nèi)液，待細(xì)胞封接穩(wěn)定后孵育30 s，待細(xì)胞內(nèi)離子螯合，再給予茜草素(10-5mol·L-1)預(yù)灌流15 s，預(yù)灌流前后腎葉間動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的外向電流(60 mV)分別為(70.2±8.1)pA和(67.8±11.2)pA(n=6，P>0.05)，見(jiàn)Fig 4。

Fig 3　Nimodipine inhibits alizarin

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 4　Ca2+ inhibits alizarin enhancing effect in intracellular fluid(n=6)

*P<0.05vscontrol

2.5ryanodine受體介導(dǎo)茜草素增強(qiáng)腎葉間動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞外向電流將ryanodine加入(ryanodine受體調(diào)節(jié)劑，10 μmol·L-1)電極內(nèi)液，待細(xì)胞封接穩(wěn)定后孵育30 s，再給予茜草素(10-5mol·L-1)預(yù)灌流15 s，預(yù)灌流前后腎葉間動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的外向電流(60 mV)分別為(56.2±9.4)pA和(54.8±7.7)pA(n=6，P>0.05)，見(jiàn)Fig 5。

Fig 5　10 μmol·L-1 ryanodine inhibits alizarin mediated outward currents(n=6)

*P<0.05vscontrol

3　討論

茜草素舒張腎葉間動(dòng)脈，增強(qiáng)其平滑肌細(xì)胞膜介導(dǎo)的外向電流，導(dǎo)致細(xì)胞膜超極化，從而引起腎葉間動(dòng)脈舒張，特異性BKCa抑制劑伊比利亞毒素(ibTX)抑制茜草素的增強(qiáng)作用提示茜草素增強(qiáng)的腎葉間動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜外向電流由BKCa介導(dǎo)[9]。

有研究發(fā)現(xiàn)平滑肌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的升高是BKCa激活的重要條件[10]，去除細(xì)胞外液中的鈣離子，將消化分離的單個(gè)平滑肌在無(wú)鈣的細(xì)胞外液中孵育30 min，茜草素對(duì)腎葉間動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的外向電流增加作用消失，間接提示茜草素增強(qiáng)BKCa介導(dǎo)的外向電流所需的鈣離子來(lái)源于細(xì)胞膜外。

L-鈣通道抑制劑尼莫地平(nimodipine)抑制茜草素增強(qiáng)的BKCa介導(dǎo)的外向電流提示細(xì)胞膜外的鈣離子通過(guò)激活L-鈣通道后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，這與Wu等[4]研究結(jié)果相一致。

有研究表明[12]，胞質(zhì)中鈣離子濃度達(dá)到5 μmol·L-1時(shí)BKCa被激活。在電極內(nèi)液中加入鈣離子螯合劑BAPTA-AM，茜草素對(duì)葉間動(dòng)脈的增強(qiáng)作用被抑制，也提示細(xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度在激活BKCa中的重要作用。

Plüger等[13]研究發(fā)現(xiàn)平滑肌內(nèi)肌漿網(wǎng)ryanodine受體被激活后，引起平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)中發(fā)生“鈣火花”，進(jìn)一步激活其周圍的BKCa，我們?cè)陔姌O內(nèi)液中加入ryanodine(選擇性ryanodine受體調(diào)節(jié)劑，10 μmol·L-1)，茜草素的增強(qiáng)作用被抑制，提示茜草素間接激活ryanodine受體[13]，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，最終激活BKCa，引起鉀離子外流，平滑肌細(xì)胞超極化，腎葉間動(dòng)脈血管舒張[9]。茜草素是否在平滑肌細(xì)胞內(nèi)引起“鈣火花”，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

細(xì)胞質(zhì)中鈣離子的升高有兩個(gè)途徑：細(xì)胞外流入和細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)釋放[4,13]。在靜息狀態(tài)下，平滑肌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離的鈣離子濃度是0.1 μmol·L-1，當(dāng)肌細(xì)胞興奮出現(xiàn)后，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度快速上升至1～10 μmol·L-1[11]。即當(dāng)細(xì)胞外鈣離子通過(guò)相應(yīng)通道進(jìn)入胞質(zhì)后觸發(fā)“鈣內(nèi)流激活鈣釋放”：即“細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子進(jìn)入胞質(zhì)”[13]，胞質(zhì)中快速升高的鈣離子濃度是平滑肌細(xì)胞收縮的重要條件，同時(shí)也是BKCa激活[12]的重要條件。因此，我們推測(cè)：平滑肌細(xì)胞興奮后，鈣離子由細(xì)胞外通過(guò)鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在鈣離子濃度尚未達(dá)到激活BKCa的條件下，平滑肌細(xì)胞發(fā)生收縮，但為了保持生理平衡，當(dāng)鈣離子濃度達(dá)到5 μmol·L-1時(shí)，BKCa被激活[12]，鉀離子外流，平滑肌細(xì)胞復(fù)極化，血管舒張。

總之通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)：茜草素通過(guò)激活L-鈣通道，促使細(xì)胞膜外鈣離子進(jìn)入胞質(zhì)中，細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，進(jìn)一步激活肌漿網(wǎng)上ryanodine受體，導(dǎo)致內(nèi)鈣釋放，可能導(dǎo)致胞質(zhì)中產(chǎn)生 “鈣火花”，“ 鈣火花”附近BKCa被激活[13]，導(dǎo)致鉀離子外流，平滑肌細(xì)胞超極化，最終引起腎葉間動(dòng)脈舒張。

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Alizarin activates large-conductance Ca2+-activated K+channels on renal interlobar arterial vascular smooth muscle cells in Wistar rat

HE Qiong, WANG Jia-ning,GAN Yan-jie, WANG Yuan-yuan,ZHANG Chuan-lin

(HeartCenter,RenminHospital,HubeiUniversityofMedicine,ShiyanHubei442000,China)

AimTo investage the regulatory effect of alizarin on renal interlobar arterial smooth muscle cells.MethodThe effect of alizarin on BKCachannels was observed by whole-cell patch clamp recording technique.ResultsSelective BKCachannel blocker ibTX inhibited alizarin-induced outward current(P<0.05); single smooth muscle cells were incubated in extracellular fluid with no Ca2+30 minutes, selective L-Ca2+channel blocker nimodipine, selective calcium ion chelating agent BAPTA-AM and ryanodine inhibited the alizarin-induced BKCachannels current, too(P<0.05).ConclusionAlizarin relaxes renales interlobar arterial smooth muscle via activation of L-Ca2+channel firstly, which lead to Ca2+flowed into cytoplam, and rising of Ca2+in cytoplam ryanodine receptor indirectly, and BKCais activated at last.

alizarin; patch clamp recording; renal interlobar arterial; BKCa; Ca2+; smooth musclecell

2016-05-09,

2016-06-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81270221)；十堰市科技局項(xiàng)目(No 15Y34)

何瓊(1976-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：心臟電生理,E-mail:zcllovexq@126.com；

張傳林(1985-)，男，碩士，研究方向：心臟和血管電生理學(xué)，通訊作者，E-mail:drzhangchuanlin@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.015

A

1001-1978(2016)09-1264-04

R-332；R284. 1；R322. 74； R329.24

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.030.html