張秋艷，唐　靈，王　艷，周　康，張慧云

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年內(nèi)科，廣西 桂林　541001)

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絞股藍(lán)皂苷對(duì)AGEs誘導(dǎo)下人腎小球系膜細(xì)胞中RAGE及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)的影響

張秋艷，唐靈，王艷，周康，張慧云

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年內(nèi)科，廣西 桂林541001)

目的觀察絞股藍(lán)皂苷(gypenosides，GP)對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)誘導(dǎo)下人腎小球系膜細(xì)胞(human mesangial cells，HMCs)中晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)表達(dá)的影響。方法將體外培養(yǎng)的(體積分?jǐn)?shù)為0.15的FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液)人腎小球系膜細(xì)胞(HMCs)分為4組：正常組、模型組、GP組、陽(yáng)性對(duì)照組。除正常組外，其余組均再給予200 mg·L-1AGEs 刺激。此外，GP組中加入不同濃度GP(25、75、175 mg·L-1)進(jìn)行干預(yù)，陽(yáng)性對(duì)照組中加入氨基胍鹽酸鹽(10-1mmol·L-1)。應(yīng)用 Western blot技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中RAGE和TGF-β1蛋白的表達(dá)；RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中RAGE和TGF-β1mRNA的表達(dá)。結(jié)果模型組 AGEs 誘導(dǎo)下HMCs 中RAGE、TGF-β1蛋白及 mRNA 表達(dá)水平明顯高于正常組(P<0.01)；與模型組比較，GP組中GP可明顯下調(diào)HMCs中RAGE、TGF-β1蛋白及mRNA的表達(dá)，且呈濃度依賴性(P<0.01)。結(jié)論GP可降低 AGEs 誘導(dǎo)下 HMCs中RAGE的表達(dá)，阻斷AGEs-RAGE信號(hào)通路，并下調(diào)下游因子TGF-β1的表達(dá)，進(jìn)而延緩糖尿病腎病纖維化進(jìn)程。

絞股藍(lán)皂苷; 糖尿病腎病; 人腎小球系膜細(xì)胞; 晚期糖基化終末產(chǎn)物; 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體; 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1; 纖維化

糖尿病腎病(diabetes nephropathy, DN)是糖尿病引起的一種極高危的慢性微血管并發(fā)癥，終可發(fā)展為終末期腎病(ESRD)，起病隱匿且發(fā)展緩慢，具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，是糖尿病患者死亡的主要原因[1-2]。長(zhǎng)期糖代謝紊亂導(dǎo)致大量 AGEs 的形成與蓄積，AGEs 與其受體 RAGE 結(jié)合，激活 AGEs-RAGE 信號(hào)通路，增強(qiáng)下游細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的表達(dá)活性，加快纖維化進(jìn)程，促進(jìn)DN惡化[3-4]。腎臟纖維化是 DN病理變化的中心環(huán)節(jié)及其發(fā)展為 ESRD的共同途徑[5]。故有效地抑制 AGEs 的形成及阻斷 AGEs-RAGE信號(hào)通路的同時(shí)，并下調(diào)下游細(xì)胞因子的表達(dá)，不僅可延緩 DN 發(fā)展，還能遏制腎臟纖維化這一核心環(huán)節(jié)，發(fā)揮雙管齊下的作用，對(duì)抑制或逆轉(zhuǎn)DN意義重大。絞股藍(lán)是一種葫蘆科中草藥，美譽(yù)為“南方人參”。 已有研究發(fā)現(xiàn)[6-7]絞股藍(lán)及其制劑具有降血糖、抗纖維化等廣泛藥理學(xué)作用，可干預(yù) DN 多個(gè)病理環(huán)節(jié)，具有保護(hù)腎臟的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察 GP 對(duì) AGEs 誘導(dǎo)下 HMCs 中RAGE和 TGF-β1表達(dá)的影響，初步探討其在延緩 DN 發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制，為GP抗DN提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料及儀器HMCs(湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)); DMEM低糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(美國(guó)，Gibco公司) ;晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)(美國(guó)，Biovision 公司)；胎牛血清 FBS(南美，GEMINI)；GP(標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，每支20 mg)(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；氨基胍鹽酸鹽 (Aminoguanidine hydrochloride，AG，美國(guó)，Sigma)；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒及 PCR 引物(美國(guó)，Invitrogen)；PCR MasterMix及DNA Marker (中國(guó)，天根生化科技北京有限公司) ； GAPDH 鼠抗人單克隆抗體(中國(guó), 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司); RAGE 兔抗人多克隆抗體(美國(guó)，ABGENT 公司)；TGF-β1 兔抗人單克隆抗體(美國(guó)，Santa Cruz公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)，MENOAI 公司) ; iMark 型酶標(biāo)儀及 PCR 基因擴(kuò)增儀(美國(guó)，Bio-Rad);TDL-80-2B低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DYY-6D 型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將HMCs接種于體積分?jǐn)?shù)為0.15的FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁面積達(dá)培養(yǎng)瓶的80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)，取3～6代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2藥物配制AGEs與體積分?jǐn)?shù)為0.15的FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液配制成濃度為200 mg·L-1的培養(yǎng)液，再加入不同劑量的GP，分別配制終濃度為25、75、175 mg·L-1的培養(yǎng)液，4℃保存?zhèn)溆?。將?yáng)性藥物氨基胍配制成終濃度為10-1mmol·L-1的溶液，-20℃保存。

1.2.3給藥及分組將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMCs以每瓶5×105個(gè)的數(shù)量接種于一次性培養(yǎng)瓶，在 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，采取隨機(jī)化原則分組：正常組(體積分?jǐn)?shù)為0.15的FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液)；模型組(200 mg·L-1AGEs)；GP組(25、75、175 mg·L-1)；陽(yáng)性對(duì)照組(氨基胍10-1mmol·L-1)。

1.2.4Western blot檢測(cè)HMCs中RAGE及TGF-β1蛋白的表達(dá)用0.25%胰酶消化各組細(xì)胞后，分裝至1.5 mL EP管，再分別加入150 μL細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30 min，反復(fù)吹打，充分裂解細(xì)胞。4℃，12 000 r·min-1，離心20 min后，收集上清并測(cè)定各組蛋白濃度。取30 μg蛋白，加入適量5×Buffer上樣緩沖液，沸水煮5～10 min使其完全變性，-80℃保存?zhèn)溆?。?2%分離膠與5%濃縮膠，電泳100 V，2 h后，4℃恒流，260 mA，轉(zhuǎn)膜90 min將蛋白轉(zhuǎn)至PDVF膜上。用含5%脫脂牛奶的 TBST 封閉2 h后，TBST 洗膜3次, 加入一抗(GAPDH鼠抗人單克隆抗體、RAGE兔抗人多克隆抗體及TGF-β1兔抗人單克隆抗體)4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3次，再加入相應(yīng)二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，在暗室加適量 ECL發(fā)光，覆上膠片、顯影及定影。掃描底片，采用 Quantity One分析灰度值，得出相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5RT-PCR 檢測(cè) HMCs 中 RAGE 及 TGF-β1mRNA 的表達(dá)取生長(zhǎng)良好的HMCs按每瓶5×105個(gè)的數(shù)量種植于一次性培養(yǎng)瓶。根據(jù)TRIzol法提取各組細(xì)胞總 RNA 并檢測(cè)濃度。依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用書合成 cDNA，以 cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體系為25 μL。由Invitrogen公司合成引物，引物序列如下：RAGE:上游5′-TGGGATGGAAGTGCAGAGGT-3′；下游5′-TGGCGGTTTCCAAGACATTC-3′; TGF-β1：上游5′-CGTCTGCTGAGGCTCAAGTTA-3′；下游5′-CACAACTCCGGTGACATCAAA-3′; GAPDH：上游 5′-CAGGAATGGAAAGGAGACCAA-3′；下游 5′-TAGCTTCCCTCCGACACACA-3′。PCR的反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃、3 min，94℃變性、30 s、退火溫度1 min(RAGE 退火溫度：57℃；TGF-β1 退火溫度：59.3℃；GAPDH退火溫度：59℃)，復(fù)性72℃、1 min，共30次后，再延伸72℃、5 min。分別取5 μL PCR產(chǎn)物，加樣于2%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔，電泳30 min，置于凝膠成像分析儀觀察結(jié)果并拍照，運(yùn)用 sensiAnsys 凝膠圖像分析軟件分析電泳圖像，測(cè)量各條帶的灰度值，得出各因子 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1GP對(duì)AGEs誘導(dǎo)下各組HMCs中RAGE及TGF-β1蛋白表達(dá)的影響由Fig 1～2可見(jiàn)：體外培養(yǎng)條件下，HMCs 內(nèi) RAGE 及 TGF-β1蛋白低表達(dá)，AGEs 刺激能促使其異常高表達(dá)。與正常組比較，模型組 HMCs 內(nèi) RAGE 及 TGF-β1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)各GP組及陽(yáng)性對(duì)照組RAGE及TGF-β1蛋白表達(dá)量明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。給予GP及陽(yáng)性藥物氨基胍干預(yù)后，可明顯下調(diào) RAGE 及 TGF-β1蛋白表達(dá)水平，與模型組比較，各GP組及陽(yáng)性對(duì)照組RAGE及TGF-β1蛋白表達(dá)量下調(diào)，且各GP組呈濃度依賴性下調(diào) RAGE 及 TGF-β1表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 1　Effect of gypenosides on

A: Normal group；B:Model group(AGEs 200 mg·L-1)；GP group(C:25、D:75 mg·L-1;E:175 mg·L-1); F:Positive control group(AG 10-1mmol·L-1).**P<0.01vsnormal group；##P<0.01vsmodel group

Fig 2　Effect of gypenosides on expression

A:Normal group；B:Model group(AGEs 200 mg·L-1)；GP group(C:25 mg·L-1；D:75 mg·L-1；E:175 mg·L-1)；F: Positive control group(AG 10-1mmol·L-1).**P<0.01vsnormal group；##P<0.01vsmodel group

2.2AGEs誘導(dǎo)下GP對(duì)各組HMCs中RAGE及TGF-β1mRNA表達(dá)的影響由Fig 3～4可見(jiàn)：正常組HMCs內(nèi)RAGE及TGF-β1mRNA低表達(dá)。AGEs 誘導(dǎo)HMCs 72 h后，與正常組比較，模型組RAGE及TGF-β1mRNA表達(dá)量明顯增高，各GP組及陽(yáng)性對(duì)照組RAGE及TGF-β1mRNA表達(dá)量也上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。給予GP干預(yù)后，可明顯下調(diào)RAGE及TGF-β1mRNA表達(dá)，與模型組比較，各GP組及陽(yáng)性對(duì)照組RAGE及TGF-β1mRNA表達(dá)量下調(diào)，且各GP組呈濃度依賴性下調(diào)RAGE及TGF-β1mRNA表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 3　Effect of gypenosides on

A:Normal group；B:Model group(AGEs 200 mg·L-1)；GP group(C:25 mg·L-1；D:75 mg·L-1；E:175 mg·L-1)；F: Positive control group(AG 10-1mmol·L-1).**P<0.01vsnormal group；##P<0.01vsmodel group

Fig 4　Effect of gypenosides on

A:Normal group；B:Model group(AGEs 200 mg·L-1)；GP group(C:25 mg·L-1；D:75 mg·L-1；E:175 mg·L-1)；F: Positive control group(AG 10-1mmol·L-1).**P<0.01vsnormal group；##P<0.01vsmodel group

3　討論

DN是糖尿病并發(fā)癥中危害最大的慢性血管病變之一，已成為 ESRD 主要的致病原因。其病理特點(diǎn)為腎小球肥大，基底膜增厚及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)異常堆積，終發(fā)展為腎小管間質(zhì)纖維化等，導(dǎo)致腎功能衰竭[8-9]。

腎小球系膜細(xì)胞(GMC)是腎小球中最為活躍的固有細(xì)胞，也是腎臟纖維化進(jìn)程中產(chǎn)生纖維化因子的主要靶細(xì)胞[10]。長(zhǎng)期慢性高血糖環(huán)境下，體內(nèi)蛋白質(zhì)與還原糖可形成一種不可逆的非酶糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)，不僅是 DN發(fā)展最關(guān)鍵的始動(dòng)因子，還與腎臟纖維化發(fā)展有著密切聯(lián)系。既往研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，當(dāng)系膜細(xì)胞受到外源性 AGEs 刺激后，可直接導(dǎo)致系膜細(xì)胞增生，基底膜增厚及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度聚集，最終導(dǎo)致腎小球硬化或小管間質(zhì)纖維化等病理性改變。此外，還可通過(guò)與其系膜細(xì)胞上特異性受體(RAGE)結(jié)合，激活 AGEs-RAGE 通路，誘導(dǎo)并增強(qiáng)下游TGF-β1及其他致纖維化細(xì)胞因子的表達(dá)，加快纖維化進(jìn)程，促進(jìn)DN惡化[13]。

腎臟纖維化是各種腎臟疾病的共同病理基礎(chǔ)，也是慢性腎功能衰竭的必經(jīng)途徑，其發(fā)展程度與腎功能的關(guān)系極為密切，能可靠地反映DN的預(yù)后[14]。目前認(rèn)為，在腎臟纖維化病程中主要致纖維化因子包括TGF-β1、PDGF、VEGF及CTGF等。其中，TGF-β1是 DN 纖維化病程中研究最多、致纖維化作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，在 DN 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15]。TGF-β1不僅可直接介導(dǎo) DN 纖維化病理改變的核心環(huán)節(jié)，還可通過(guò)受體信號(hào)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分泌、凋亡及腎小球硬化等多個(gè)病理過(guò)程[16-17]。

DN時(shí)多種因素可誘導(dǎo)TGF-β1表達(dá)異常升高，TGF-β1可刺激細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增加，進(jìn)而引起系膜區(qū)擴(kuò)張、基底膜增厚，導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化[18]。李業(yè)瓊等[19]研究發(fā)現(xiàn)DN大鼠中AGEs 的聚集增加，還可誘導(dǎo) RAGE 異常高表達(dá)，參與DN的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示[20]： AGEs 誘導(dǎo)刺激 HMCs 中 RAGE 高度表達(dá)，并上調(diào)下游因子 TGF-β1活性。已有研究表明，抑制 TGF-β1表達(dá)活性，在一定程度上可減輕和延緩腎臟纖維化進(jìn)展，對(duì)防治DN具有重要意義。

近年來(lái)，中藥在 DN 治療方面頗具特色，并取得了一定療效。GP 是一種名貴的中草藥，稱之“第二人參”。不斷有研究表明，GP 在降血糖及改善糖尿病并發(fā)癥方面具有明顯作用[21]。陶利花等[22]觀察了絞股藍(lán)皂苷對(duì)糖尿病模型的相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷可抑制AGEs及RAGE，降低TGF-β1活性，用于糖尿病腎病早期治療。王雁秋等[23]發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷可抑制糖尿病腎臟VEGF表達(dá)，具有保護(hù)腎臟的作用。由此可見(jiàn)，絞股藍(lán)皂苷對(duì)糖尿病腎病纖維化有一定的抑制作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GP能抑制AGEs誘導(dǎo)下HMCs增殖及ECM堆積，改善氧化應(yīng)激水平，延緩DN發(fā)展進(jìn)程[24-25]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，給予不同劑量GP及陽(yáng)性藥物氨基胍干預(yù)后，可明顯下調(diào)HMCs中RAGE及TGF-β1mRNA及蛋白的異常高表達(dá)，且呈濃度依賴性。故可推測(cè) GP 可通過(guò)阻斷 AGEs-RAGE 信號(hào)通路，下調(diào)致纖維化因子TGF-β1的表達(dá)，從而延緩DN纖維化進(jìn)程。氨基胍是目前研究中認(rèn)為作用最強(qiáng)的AGEs抑制劑之一，可阻斷AGEs-RAGE信號(hào)通路，但因其毒性較大，未能用于臨床治療[26]，故作為本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照。

目前，GP抗纖維化機(jī)制的文獻(xiàn)報(bào)道多來(lái)源于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，關(guān)于GP 抗纖維化的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用 AGEs 體外培養(yǎng)的HMCs為研究模型，同時(shí)給予不同濃度GP進(jìn)行干預(yù)，觀察 GP對(duì)AGEs誘導(dǎo)下HCMs中RAGE及TGF-β1表達(dá)的影響，初步探討其在延緩DN發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制。

綜上所述，GP可抑制AGEs誘導(dǎo)下HMCs中RAGE的異常表達(dá)，同時(shí)降低 TGF-β1的活性。由此推測(cè)GP可發(fā)揮類似于氨基胍的作用，抑制AGEs的形成及阻斷AGEs-RAGEs信號(hào)通路，并下調(diào)致纖維化因子TGF-β1的活性表達(dá)，從而延緩腎臟纖維化發(fā)展進(jìn)程，為防治DN發(fā)展提供新的策略。此外，GP是否還可通過(guò)阻斷其它機(jī)制，如 NF-κB、PKC等信號(hào)通路，從而延緩 DN 纖維化進(jìn)展，仍待研究證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)僅從體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)論證具有局限性，應(yīng)結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)，為GP 在早期預(yù)防及治療DN 纖維化發(fā)展提供更多可靠的理論依據(jù)。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成，感謝實(shí)驗(yàn)室老師們對(duì)本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助！)

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Effect of gypenosides on RAGE and TGF-β1expression in human mesangial cells induced by AGEs

ZHANG Qiu-yan，TANG Ling， WANG Yan， ZHOU Kang, ZHANG Hui-yun

(DeptofGeriatrics，theAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,GuilinGuangxi541001,China)

AimTo observe the effect of gypenosides(GP) on the expression of receptor for advanced glycated endproducts(RAGE) and transforming growth factor-β1(TGF-β1) in human mesangial cells(HMCs) induced by AGEs.MethodsHMCs were cultured in DMEM of low glucose containing 15% fetal bovine seruminvitro, which were divided into four groups: the normal group, model group, GP group and positive control group. In addition to the normal group, the other groups were stimulated by AGEs(200 mg·L-1); furthermore, GP group was intervened with different concentrations(25,75,175 mg·L-1) of GP, while control group was given 10 mmol·L-1of aminoguanidine hydrochloride. The expression of RAGE and TGF-β1protein of each group was detected by Western blot; the expression of RAGE and TGF-β1mRNA of each group was detected by RT-PCR. ResultsThe expression of RAGE,TGF-β1protein and mRNA in HMCs induced by AGEs in the model group was significantly higher than that of the normal group(P<0.01); compared with the positive control group(P<0.01), GP could obviously reduce the expression of RAGE,TGF-β1protein and mRNA in a dose-dependent manner.ConclusionGP can reduce the expression of RAGE in HMCs induced by AGEs, block AGEs-RAGE signaling pathway and decrease the expression of the downstream factor TGF-β1, therefore, it plays the role in the resistance of rennal fibrosis in DN.

gypenosides;diabetic nephropathy；human mesangial cells;advanced glycation endproducts;receptor for advanced glycated endproducts;TGF-β1;fibrosis

2016-04-22,

2016-05-26

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2013GXNSFAA019197);廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)計(jì)委項(xiàng)目(No Z2016387)；桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(No 20120121-1-1)

張秋艷(1990-)，女，碩士生，研究方向:糖尿病及其并發(fā)癥,E-mail：214180720@qq.com;

唐靈(1967-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向:糖尿病及其并發(fā)癥,通訊作者,E-mail： tanglinggem@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.022

A

1001-1978(2016)09-1301-06

R284.1；R322.61；R587.2；R692.39；R977.6

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