王瓊　史冬梅　劉維達(dá)

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，南京 210042;2.濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院皮膚科，濟(jì)寧 272011)

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·論著·

小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞對白念珠菌吞噬、殺傷作用的研究

王瓊1史冬梅2劉維達(dá)1

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，南京 210042;2.濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院皮膚科，濟(jì)寧 272011)

目的體外分離培養(yǎng)小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)并與白念珠菌共同孵育，研究不同濃度的DC對白念珠菌的吞噬、殺傷作用，并研究隨著共孵育時間的延長DC表型的變化及其吞噬、殺傷白念珠菌能力的變化。方法無菌條件下分離培養(yǎng)C57小鼠骨髓DC；倒置顯微鏡下觀察DC的形態(tài)；Cellometer Mini細(xì)胞計數(shù)儀測定DC生長曲線及細(xì)胞直徑變化；流式細(xì)胞儀檢測DC及白念珠菌刺激后DC表面標(biāo)志物CD11c及其表面分子MHCⅡ、CD40、CD80及CD86的表達(dá)；光學(xué)顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞儀測定DC對白念珠菌的吞噬及殺傷作用。結(jié)果體外培養(yǎng)10 d小鼠骨髓DC，倒置顯微鏡觀察可見典型DC形態(tài)；隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞逐漸增大，培養(yǎng)第10天時，細(xì)胞直徑分布最多的為10.2 μm；生長曲線顯示，DC呈倍數(shù)增長，第2～9天為細(xì)胞對數(shù)生長期，第9天左右增殖曲線達(dá)到頂峰。培養(yǎng)第10天，未經(jīng)白念珠菌刺激的DC表面CD11c分子及CD80分子高水平表達(dá)，CD40、CD86及MHCⅡ低表達(dá)；經(jīng)白念珠菌刺激后，DC表面CD11c分子、CD80、CD40、CD86及MHCⅡ均高表達(dá)，呈成熟DC表型。激光共聚焦(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)及流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer，F(xiàn)CM)檢測DC對白念珠菌吞噬作用，當(dāng)DC與白念珠菌的比例為1∶1時，隨著共培養(yǎng)時間的延長(30 min～1.5 h)，吞噬率無明顯變化(P=0.063)；當(dāng)DC與白念珠菌比例為2∶1、1∶2及1∶4，隨著DC細(xì)胞所占比例的減小，DC細(xì)胞吞噬作用增強(qiáng)，當(dāng)比例為1∶4時，DC吞噬作用最強(qiáng)，且隨著共培養(yǎng)時間的延長(30 min～1.5 h)，吞噬率也明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003；P=0.002；P=0.002)。顯微鏡檢測DC對白念珠菌殺傷率，可見隨著時間的延長，各實(shí)驗(yàn)組的殺傷率下降(P=0.000)；當(dāng)DC∶白念珠菌=1∶1時，較2∶1時，殺傷率明顯下降，但隨著白念珠菌比例在一定范圍內(nèi)的增高(從1∶1到1∶4)，殺傷率明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。結(jié)論小鼠骨髓細(xì)胞體外經(jīng)GM-CSF誘導(dǎo)可培養(yǎng)DC具有較高的純度，呈未成熟細(xì)胞表型；且每只C57小鼠可獲得3×107總數(shù)的細(xì)胞，可滿足一些實(shí)驗(yàn)的DC用量。經(jīng)白念珠菌刺激后DC表型成熟；在一定的比率范圍內(nèi)，DC對白念珠菌有較強(qiáng)的吞噬及殺傷作用，其吞噬作用隨著DC與白念珠菌比例的減小而增強(qiáng)。且隨著兩者作用時間的延長，DC對白念珠菌的吞噬作用逐漸增強(qiáng)而殺傷作用逐漸減弱。

骨髓；樹突狀細(xì)胞；白念珠菌；吞噬；殺傷

[Chin J Mycol，2016，11(4):193-200]

白念珠菌是一種寄生在健康宿主消化道、呼吸道和女性生殖道黏膜的機(jī)會性致病真菌。一旦機(jī)體免疫力下降或者正常菌群平衡被破壞，它就會在黏膜表面大量繁殖并形成菌絲、侵入深層組織、引起念珠菌系統(tǒng)性感染，且這種感染常常是致命性的。白念珠菌入侵人體的第一道防線即是樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)，DC是連接天然免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，負(fù)責(zé)監(jiān)查機(jī)體中各種抗原成分并提呈抗原至下游免疫反應(yīng)，在抗真菌免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[1-3]。本研究通過原代分離培養(yǎng)小鼠骨髓來源DC，檢測不同比例下其對白念珠菌吞噬及殺傷作用，為臨床進(jìn)一步研究與應(yīng)用DC進(jìn)行白念珠菌病的免疫治療提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

SPF級C57小鼠，雌性，6～8周，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供(動物合格證編號SCXK(蘇2012-0004))提供。白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC5314)，由中國醫(yī)學(xué)真菌保藏管理中心保藏。重組粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF，Propetech公司)、RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)、胎牛血清(Gibco公司)、PBS緩沖液(實(shí)驗(yàn)室自配)、75%乙醇(實(shí)驗(yàn)室自配)、胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、FITC(sigma公司)、抗鼠CD11c、CD40、CD80、CD86、MHCⅡ熒光抗體(eBioscience公司)。

1.2小鼠骨髓來源DC的培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

取C57小鼠，頸椎脫臼處死，立即浸入75%乙醇中5～10 min；在超凈工作臺中，無菌手術(shù)取出脛骨及股骨，盡量將肌肉和結(jié)締組織去除干凈。放于PBS緩沖液中，剪掉骨的兩端，用1 mL無菌注射器反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨變白，將沖洗液收入15 mL離心管中，離心(800×g，5 min)棄上清，收集沉淀的骨髓細(xì)胞。以含10% FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并加入200 U/mL GM-CSF細(xì)胞因子，將細(xì)胞搖勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天第2天加入等量含有200 U/mL GM-CSF的完全培養(yǎng)基；第6天、第8天半量換液。每天觀察DC形態(tài)變化、大小、數(shù)量、分布及細(xì)胞集落生長狀況，于培養(yǎng)后第1、3、5、7、10天拍照并用Cellometer Mini細(xì)胞計數(shù)儀記錄細(xì)胞生長直徑變化。

1.3小鼠骨髓來源DC生長曲線

取原代分離小鼠骨髓DC，將細(xì)胞懸液按照2×104/mL接種于24孔培養(yǎng)板，12 h后開始計數(shù)，每天取3個孔，用Cellometer Mini細(xì)胞計數(shù)儀分別計數(shù)，計算平均值，共計10 d。根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)/mL)為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.4流式細(xì)胞儀檢測DC表面分子的表達(dá)

收集培養(yǎng)第10天的DC，分為處理組和對照組。處理組與白念珠菌共培養(yǎng)1 h，對照組不加白念珠菌，流式細(xì)胞術(shù)檢測處理組及對照組的DC表型。將培養(yǎng)第7天的細(xì)胞用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL。加入FITC標(biāo)記的抗鼠CD11c熒光抗體，PE標(biāo)記的抗鼠CD40、CD80、CD86、MHCⅡ熒光抗體，室溫避光孵育20 min，洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2.5 mL，去除游離的熒光抗體，再用2%的多聚甲醛固定液500 μL重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測CD11c 、CD40、CD80、CD86、MHCⅡ分子的表達(dá)，F(xiàn)lowJo軟件分析。

1.5激光共聚焦檢測DC對白念珠菌吞噬作用[4]

白念珠菌培養(yǎng)及染色白念珠菌于沙堡弱培養(yǎng)基(1%蛋白胨，2%瓊脂，4%麥芽糖)培養(yǎng)48 h，挑取沙堡弱培養(yǎng)基上的白念珠菌轉(zhuǎn)種于YPD液體培養(yǎng)基(2%葡萄糖，1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物)，30℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)8 h。取上述培養(yǎng)好的白念珠菌，離心(1 500×g，5 min)，PBS洗2遍，調(diào)整菌液濃度至5×105/mL，倒掉上清后，加入200 μL FITC溶液(1.25 mmol/L FITC溶于含0.5% DMSO的0.1 mmol/L NaHCO3溶液中，PH9.0)標(biāo)記，37℃，避光振搖染色1.5 h，PBS沖洗2遍，備用。

DC細(xì)胞與白念珠菌共培養(yǎng)取培養(yǎng)第10天的DC，每個培養(yǎng)皿接種5×105個細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。分別按DC∶白念珠菌2∶1、1∶1、1∶2、1∶4的比例加入FITC熒光標(biāo)記的白念珠菌作為試驗(yàn)組，同時按相同比例加入未染色白念珠菌作為對照組，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)1 h；將共培養(yǎng)物加入離心管中，PBS洗滌2次，棄掉上清液，后按照PKH26染液說明書進(jìn)行后續(xù)染色操作：向上述沉淀中加入少量的稀釋液C重懸細(xì)胞，后加入事先準(zhǔn)備好的PKH26染液(用稀釋液C稀釋)，立即用吸管均勻快速混合樣品，室溫孵育4 min(期間輕輕顛倒離心管混勻使染色充分)，加入等量血清終止染色反應(yīng)，孵育1 min，用等量含血清培養(yǎng)基稀釋中止的反應(yīng)液，800 g離心10 min，去上清，PBS清洗3次，制片，激光共聚焦檢測。

1.6流式細(xì)胞儀檢測DC對白念珠菌吞噬作用

按照“DC細(xì)胞與白念珠菌共培養(yǎng)”的步驟，DC細(xì)胞和FITC染色的白念珠菌分別共培養(yǎng)30 min、1 h、1.5 h后，每孔加入100 μL臺盼藍(lán)(250 mg/mL)，室溫放置1 min以淬滅熒光，PBS洗滌2遍，再用2%的多聚甲醛固定液500 μL重懸，流式細(xì)胞儀檢測FITC熒光的表達(dá)，同時設(shè)DC細(xì)胞和未染色的白念珠菌做陰性對照。

1.7DC對白念珠菌的殺傷作用[5]

收集第10天的DC，按每孔4×104的密度接種于96孔板，每孔加入100 μL含10% FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，并加入200 U/mL GM-CSF細(xì)胞因子，將細(xì)胞搖勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。之后實(shí)驗(yàn)組分別按DC∶白念珠菌2∶1、1∶1、1∶2、1∶4的比例加入新鮮振搖過夜的白念珠菌，后每孔1∶6倍比稀釋；對照組中不加細(xì)胞，白念珠菌接種比例同實(shí)驗(yàn)組。所有組均設(shè)3個復(fù)孔。分別于共培養(yǎng)后24 h、48 h用顯微鏡計數(shù)96孔板中的菌落數(shù)，從左至右菌落數(shù)逐漸減少，觀察可清楚計數(shù)的孔(比如第6列可清楚計數(shù)則乘以依次的稀釋倍數(shù)65，即為第一列的菌落數(shù))。DC對白念珠菌殺傷比率=(1-實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)/對照組菌落數(shù))×100%。所有組均設(shè)3個復(fù)孔。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)　　果

2.1倒置顯微鏡觀察小鼠骨髓來源DC形態(tài)

從倒置顯微鏡下可以看出，新鮮分離的小鼠骨髓來源DC呈圓形、透亮、體積小；第3天后，在細(xì)胞因子的刺激下細(xì)胞數(shù)量明顯增多、體積增大、形狀不規(guī)則，可見細(xì)胞向各個方向伸展細(xì)小偽足、大小不一、有細(xì)胞聚集現(xiàn)象、呈集落樣生長；培養(yǎng)5天后，細(xì)胞成簇生長，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形較小，細(xì)胞周邊可見明顯的細(xì)胞毛刺狀突起，大部分細(xì)胞呈半懸浮狀態(tài)，細(xì)胞體積較以前增大；培養(yǎng)10 d后，多數(shù)細(xì)胞具有毛刺狀突起(見圖1)。

2.2小鼠骨髓來源DC直徑變化

Cellometer Mini細(xì)胞計數(shù)儀記錄DC生長直徑變化(見圖2)，培養(yǎng)第1天，DC細(xì)胞直徑較小，分布最多的直徑約為5.7 μm；培養(yǎng)第3天，DC直徑分布最多的增加到7.9 μm；第5天，增加到8.3 μm；培養(yǎng)到第7天，直徑增加到8.6 μm；到第10天時，細(xì)胞直徑增加到10.2 μm。由直徑變化可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞逐漸增大，此結(jié)果與顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)果一致。

2.3小鼠骨髓來源DC生長曲線

通過10 d連續(xù)計數(shù)，其生長曲線顯示(見圖3)，DC呈倍數(shù)增長，DC在培養(yǎng)第2～9天為細(xì)胞對數(shù)生長期，第9天左右增殖曲線達(dá)到頂峰，停止生長，進(jìn)入平臺期。

2.4流式細(xì)胞儀檢測DC表面分子的表達(dá)

對照組DC表面高水平表達(dá)CD11c分子及CD80分子，分別占93.85.67%±2.90%及84.83%±0.31%，CD40、CD86及MHCⅡ低表達(dá)，分別為36.4%±0.82%、44.87%±2.44%及33.2%±0.75%；經(jīng)白念珠菌刺激后，DC表面CD11c、CD80、CD40、CD86及MHCⅡ均高表達(dá)，分別為92.4%±0.62%、98.27%±0.71%、92.17%±0.76%、90.73%±0.35%及95.7%±0.46%，見圖4。

2.5熒光顯微鏡檢測白念珠菌染色效果

熒光顯微鏡下觀察FITC染色白念珠菌，可見鏡下白念珠菌呈綠色，明顯可見真菌形態(tài)，孢子可見，染色效率可達(dá)98%以上(見圖5)，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6激光共聚焦檢測DC對白念珠菌吞噬作用

PKH26是一種對細(xì)胞膜脂質(zhì)非常敏感的紅色熒光染料，熒光顯微鏡下可見標(biāo)記PKH26的DC，染料在細(xì)胞膜上分布均勻一致，細(xì)胞呈紅色熒光，標(biāo)記效率達(dá)100%。通過激光共聚焦掃描成像可以準(zhǔn)確地觀察到單個DC細(xì)胞吞噬白念珠菌的情況(見圖6)。由圖6可見，隨著DC∶白念珠菌比例的減小(由2∶1到1∶4)，DC細(xì)胞吞噬作用增強(qiáng)，圖6e顯示DC∶白念珠菌的比例為1∶4時，DC吞噬作用最強(qiáng)，每個DC細(xì)胞內(nèi)可見多個白念珠菌，最多可見9個。

2.7流式細(xì)胞儀檢測DC對白念珠菌吞噬作用

用流式細(xì)胞儀檢測不同時間DC對白念珠菌吞噬率，結(jié)果見表1?？梢娫谙嗤墓才囵B(yǎng)時間，隨著DC∶白念比例的減小(由2∶1到1∶4)，DC細(xì)胞吞噬作用增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000；P=0.000；P=0.000)；當(dāng)DC∶白念的比例為1∶4時，DC吞噬作用最強(qiáng)，分別為8.32±0.29、11.73±0.23、11.9±1.22(見表1)，此結(jié)果與激光共聚焦觀察結(jié)果一致。DC∶白念珠菌的比例為2∶1、1∶2及1∶4時，隨著共培養(yǎng)時間的延長(30 min到1.5 h)，吞噬率也明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003；P=0.002；P=0.002)；當(dāng)DC∶白念珠菌的比例為1∶1時，隨著共培養(yǎng)時間的延長(30 min到1.5 h)，吞噬率無明顯變化(P=0.063)。

2.8DC對白念珠菌殺傷作用

培養(yǎng)后24 h，在顯微鏡下可觀察到白念珠菌菌落，分枝呈樹枝狀，見圖7。分別于共培養(yǎng)后24 h及48 h，在顯微鏡下計數(shù)白念珠菌形成菌落(見表2)，可見隨著時間的延長，各實(shí)驗(yàn)組的殺傷率下降(P=0.000)；當(dāng)DC∶白念珠菌=1∶1時，與2∶1相比，DC殺傷作用明顯下降，但隨著白念珠菌比例在一定范圍內(nèi)的增高(從1∶1到1∶4)，殺傷作用明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。

3　討　　論

DC是目前已知的唯一可以活化Th細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞，也是連接固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答的樞紐[6-7]。白念珠菌是一種自然界最常見的分布于多種組織器官的機(jī)會性致病菌[8]，包括皮膚、口腔、胃腸道、陰道等。隨著白念珠菌對各種抗真菌藥物的耐藥性逐年增加，給臨床治療帶來一定的困難。機(jī)體通過識別白念珠菌細(xì)胞壁及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行不同的免疫應(yīng)答，由于T細(xì)胞在免疫反應(yīng)中處于核心地位，而DC作為目前已知的唯一可以活化初始輔助性T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞，研究DC對白念珠菌的抗感染免疫顯得尤為重要。

DC起源于骨髓CD34+造血干細(xì)胞[9]，是1973年由Steinman和Cohn[10]首先由小鼠脾臟組織中分離發(fā)現(xiàn)。DC細(xì)胞表面具有典型的樹突狀突起，在體內(nèi)分布廣泛。DC是機(jī)體抵御病原菌及毒素等有害物質(zhì)的第一道防線，當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激后，DC可以有效地攝取抗原，并通過抗原肽/MHC分子復(fù)合物的形式，將抗原有效提呈給T0細(xì)胞，刺激生成Tc細(xì)胞，從而啟動機(jī)體相應(yīng)的免疫反應(yīng)。DC的鑒定一般要結(jié)合形態(tài)、分子表達(dá)及其功能3方面進(jìn)行。本研究從C57小鼠骨髓中分離樹突狀細(xì)胞，并對其進(jìn)行形態(tài)觀察和鑒定，經(jīng)過10 d的體外培養(yǎng)，可達(dá)到93%，細(xì)胞數(shù)量為3×107/只，基本上滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。本研究通過倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞由貼壁生長逐漸到半懸浮生長，細(xì)胞由圓形逐漸變?yōu)椴灰?guī)則，數(shù)量明顯增多，體積增大，表面出現(xiàn)大量不規(guī)則的樹突樣突起，有細(xì)胞聚集現(xiàn)象，呈集落樣典型樹突狀細(xì)胞形態(tài)。通過對DC連續(xù)10 d計數(shù)發(fā)現(xiàn)，DC呈倍數(shù)增長，DC在培養(yǎng)第2～9天為細(xì)胞對數(shù)生長期，第9天左右增殖曲線達(dá)到頂峰，停止生長，進(jìn)入平臺期。DC表面有多種表面標(biāo)志，包括CD11c、CD83、CD86、MHCⅡ、體內(nèi)大部分DC處于非成熟狀態(tài)，通常少量分布于與外界接觸的皮膚(黏膜)部位，主要為皮膚和鼻腔、肺、胃與腸的內(nèi)層，血液中也可發(fā)現(xiàn)他們的未成熟型，低水平表達(dá)的共刺激因子和黏附因子，體外激發(fā)同種混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的能力較低，但未成熟DC具有極強(qiáng)的抗原吞噬能力。作為人體的第一道防線，DC表達(dá)多種模式的識別受體，如甘露糖受體、Toll樣受體等，可單獨(dú)或協(xié)同識別多種病原微生物(細(xì)菌、真菌等)，通過胞飲作用、吞噬作用等攝取抗原進(jìn)而殺傷之，從而行使固有免疫應(yīng)答。宿主的天然免疫狀況決定了對白念珠菌致病的易感性，白念珠菌的酵母、菌絲能被DC介導(dǎo)的固有免疫系統(tǒng)識別，通過不同的機(jī)制啟動不同的免疫效應(yīng)。因此檢測DC對真菌細(xì)胞的吞噬作用及殺傷作用，可以為今后抗感染領(lǐng)域尤其是抗真菌感染領(lǐng)域加強(qiáng)以DC為基礎(chǔ)的免疫、基因治療提供基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著DC∶白念珠菌比例的減小(由2∶1到1∶4)，DC細(xì)胞吞噬作用增強(qiáng)，當(dāng)比例為1∶4時，DC吞噬作用最強(qiáng)，此結(jié)果與激光共聚焦觀察結(jié)果一致。DC∶白念珠菌的比例為2∶1、1∶2及1∶4時，隨著共培養(yǎng)時間的延長(30 min到1.5 h)，吞噬率也明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003；P=0.002；P=0.002)；然當(dāng)進(jìn)一步增加白念珠菌的比例，DC與白念珠菌比例為1∶1時，隨著共培養(yǎng)時間的延長(30 min到1.5 h)，吞噬率無明顯變化(P=0.063)。顯微鏡檢測DC對白念珠菌殺傷率，可見隨著時間的延長，各實(shí)驗(yàn)組的殺傷率下降(P=0.000)；當(dāng)DC∶白念珠菌=1∶1時，較2∶1時，殺傷率明顯下降，但隨著白念珠菌比例在一定范圍內(nèi)的增高(從1∶1到1∶4)，殺傷率明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。這提示當(dāng)體內(nèi)白念珠菌量較大時，而體內(nèi)DC量固定，DC不能有效殺傷白念珠菌，這可能是造成白念珠菌菌局部感染甚至系統(tǒng)性白念珠菌感染的原因之一。

圖1倒置顯微鏡觀察小鼠骨髓DC形態(tài)學(xué)變化：A.第1天(原始放大倍數(shù)×20)；B.第3天(×20)；C.第5天(×20)；D.第7天(×20)；E.第10天(×20)；F.第1天(×40)；G.第3天(×40)；H.第5天(×40)；I.第7天(×40)；J.第10天(×40)圖2小鼠骨髓DC平均直徑變化圖圖3小鼠骨髓來源DC生長曲線圖4DC細(xì)胞表面分子表達(dá)

Fig.1The morphological of DC were observed by optical microscope：A.1 d(original magnification 20×)；B.3 d(original magnification 20×)；C.5 d(original magnification 20×)；D.7 d(original magnification 20×)；E.10 d(original magnification 20×)；F.1 d(original magnification 40×)；G.3 d(original magnification 40×)；H.5 d(original magnification 40×)；I.7 d(original magnification 40×)；J.10 d(original magnification 40×)Fig.2The average diameter changes of DCFig.3The growth curve of mouse bone marrow-derived dendritic cellsFig.4The positive expression rates of DC

圖5熒光顯微鏡下觀察白念珠菌染色(×10，A.白光；B.熒光)圖6激光共聚焦檢測DC對白念珠菌吞噬作用(×10)：A.陰性對照；B.DC∶白念珠菌=2∶1；C.DC∶白念珠菌=1∶1；D.DC∶白念珠菌=1∶2；E.DC∶白念珠菌=1∶4圖724 h顯微鏡下觀察白念珠菌形成的菌落(×4)

Fig.5The stainedCandida albicans detected by fluorescence microscope(original magnification 10×，A.white light，B.fluorescence)Fig.6 The phagocytosis of DC against Candida albicans detected by LSCM：A.Negative control;B.DC∶Candida albicans=2∶1;C.DC∶Candida albicans=1∶1;D.DC∶Candida albicans=1∶2;E.DC∶Candida albicans=1∶4Fig.7The colony of Candida albicans detected by microscope after 24 h(original magnification 4×)

表1流式細(xì)胞儀檢測DC對白念珠菌吞噬率(%)

Tab.1The phagocytosis of DC against Candida albicans detected by flow cytometry

共培養(yǎng)時間2∶11∶11∶21∶4FP30min2.29±0.244.09±0.635.85±1.038.32±0.2938.1430.0001h2.87±0.164.91±0.855.33±1.1511.73±0.2398.7500.0001.5h3.20±0.185.61±0.149.71±0.3411.90±1.22120.9660.000F17.3464.52220.46722.680P0.0030.0630.0020.002

表2顯微鏡下計數(shù)DC對白念珠菌菌落殺傷率(%)

Tab.2The killing rates of DC against Candida albicans detected by microscope

2∶11∶11∶21∶4χ2P24h78.98±5.8123.65±9.0659.69±14.6788.87±3.14107500.00048h70.17±10.597.76±4.1838.40±14.9183.06±20.321398000.000χ2541.3345149485609P0.0000.0000.0000.000

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)自C57小鼠骨髓細(xì)胞體外單純經(jīng)GM-CSF誘導(dǎo)可培養(yǎng)DC具有較高的純度及數(shù)量，且呈未成熟DC表型，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的DC用量。通過以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)過白念珠菌刺激后DC表型成熟；DC對白念珠菌有較強(qiáng)的吞噬及殺傷作用，其吞噬作用隨著DC與白念珠菌比例的減小而增強(qiáng)。且隨著兩者作用時間的延長，DC對白念珠菌的吞噬作用逐漸增強(qiáng)而殺傷作用逐漸減弱。初步揭示了DC與白念珠菌量之間比例變化可能在白念珠菌的發(fā)病中起到關(guān)鍵性作用；DC對白念珠菌吞噬及殺傷作用的探討在白念珠感染性疾病治療中具有積極的意義。

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[本文編輯]王飛

The study of mouse bone marrow-derived dendritic cells phagocytosis and cytotoxicity against Candida albicans in vitro

WANG Qiong1,SHI Dong-mei2,LIU Wei-da1

(1.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College，Nanjing 210042,China;2.Department of Dermatology,Jining No.1 People’s Hospital,Jining 272011,China)

ObjectiveMouse bone marrow-derived dendritic cells were isolated and cultured in vitro and co-incubated with Candida albicans,in order to study the phenotype,phagocytosis and cytotoxicity of which against Candida albicans under different concentration and time.MethodsDendritic cells from C57 mouse bone marrow were isolated and cultured under aseptic conditions.The morphological and the growth curve and cell diameter of DC were observed by optical microscope and Cellometer Mini cell counter.The expression levels of CD11c,MHCII,CD40,CD80 and CD86 of DC were measured by flow cytometer.The phagocytosis and cytotoxicity of DC against Candida albicans were detected by microscope,Laser Scanning Confocal Microscope(LSCM) and flow cytometry.ResultsTypical morphology of DC cells was observed under inverted microscope 10 days after culture.10.2 μm was the most widely distributed diameter of DC as illustrated and the size of DC increased with the extension of incubation time.The growth curve showed that DC increased multiply.After inoculation,2-9 days were logarithmic phase and stagnate phase was from 9 days.The result of immunological phenotype detected by FCM showed that the CD11c and CD80 were highly expressed and MHCII,CD40,CD86 were lower expressed in control group.After stimulated by Candida albicans,the DC were appeared mature phenotype and CD11c,CD80,CD40,CD86 and MHCⅡ were all highly expressed.As the ratio(DC∶Candida albicans) reduced(from 2∶1 to 1∶4),the phagocytosis effects of DC enhanced and the strongest effect appeared when the ratio was 1∶4.When the ratio was 1∶1，the phagocytosis effects of DC was no significant change(P=0.063) with the extension of co-incubation time(30 min to 1.5 h).But when the ratio were 2∶1,1∶2 and 1∶4,the phagocytosis effects of DC were obviously rised with the extension of co-incubation time(30 min to 1.5 h),a statistically significant difference(P=0.003,P=0.002,P=0.002).When co-incubation time was prolonged,the cytotoxicity of DC was dramatic descend(P=0.000) detected by microscope.When the ratio(DC∶Candida albicans) was 1∶1,compared with the 2∶1 group,the cytotoxicity effects of DC was dramatic declined.But when the ratio of Candida albicans increased within limits(from 1∶1 to 1∶4),the cytotoxicity was significantly increased(P=0.000),with statistical significance.Conclusion Dendritic cells isolated from mouse bone marrow had high purity and immature cell phenotype.We could obtain 3×107cells per C57 mouse DC which could meet the requirements of experiments very well.After stimulated by Candida albicans,mature DCs were obvious increased.DC had strong phagocytosis and cytotoxicity against Candida albicans,and the effects of phagocytosis and cytotoxicity enhanced with the ratio(DC∶Candida albicans) reduced.When co-incubation time was prolonged,the phagocytosis of DC against Candida albicans was increased and the cytotoxicity was decreased.

bone marrow;dendritic cells;Candida albicans；phagocytosis;cytotoxicity

973計劃項(xiàng)目(2013CB531605)；國家自然科學(xué)基金(81401653)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2015HL127)；濟(jì)寧市醫(yī)學(xué)科學(xué)計劃(2014jnnk13)

王瓊，女(漢族)，碩士，主管技師.E-mail:chongziqiong@163.com

史冬梅,E-mail:shidongmei28@163.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0193-08

2016-01-20