張靜姝，余麗麗

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院, 陜西 西安　710021)

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·化學(xué)與化學(xué)工程·

流動注射毛細(xì)管電泳測定益母草中4種黃酮

張靜姝，余麗麗

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院, 陜西 西安710021)

建立了一種測定蘆丁、山奈酚、芹菜素和槲皮素的流動注射-毛細(xì)管電泳新方法。考察了緩沖溶液種類、緩沖溶液pH、緩沖溶液濃度、有機(jī)添加劑含量、分離電壓、載液流速、充樣時間和注射時間等因素對分離的影響。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,4種分析物在9 min內(nèi)完全分離?；貧w方程線性良好,相關(guān)系數(shù)為0.999 0～0.999 9,檢出限為1.95～2.59 μg/mL,遷移時間和峰面積的日內(nèi)及日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于1.64%和4.16%。用于實(shí)際樣品益母草中蘆丁、山奈酚、芹菜素和槲皮素的測定,回收率為95%～104.3%。

毛細(xì)管電泳;流動注射;益母草;黃酮

益母草為唇形科植物益母草(Leonurusjaponicus)的全草,其干燥地上部分為常用中藥,具有清熱解毒、活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫等功效[1]。此外,益母草還具有抑菌、抗血栓、改善冠脈循環(huán)、保護(hù)心血管等作用,臨床上主要用于月經(jīng)不調(diào)、瘀血腹痛、癰腫瘡瘍和心血管等疾病的治療[2]。益母草的化學(xué)成分主要為生物堿、黃酮、二萜、有機(jī)酸及糖類[1],黃酮類化合物具有防癌、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等生理活性[3],分析益母草中的黃酮類化合物具有重要意義。

益母草中黃酮類化合物的測定方法包括分光光度法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法[1,4-5]。分光光度法簡單易行,但選擇性較差,易受雜質(zhì)干擾[1];高效液相色譜法靈敏度高、準(zhǔn)確性好,但分析周期較長且色譜柱易污染[6];毛細(xì)管電泳法具有高效、快速、樣品及試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn),近年來在中草藥分析中備受關(guān)注[7-8]。然而,傳統(tǒng)間歇的進(jìn)樣方式影響了毛細(xì)管電泳的分析速度和重現(xiàn)性,限制了其應(yīng)用。流動注射-毛細(xì)管電泳(FI-CE)可在持續(xù)高壓下連續(xù)進(jìn)樣分析,有效提高了傳統(tǒng)電泳的分析速度和分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[9-11],是一種高通量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。本文采用簡單、高效的FI-CE法分析蘆丁、山奈酚、芹菜素和槲皮素,并將其用于益母草中4種黃酮的含量測定。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

HPE-100型電泳儀(美國Bio-Rad公司);未涂層石英毛細(xì)管(30.0 cm×75 μm,有效長度26.7 cm,河北永年光導(dǎo)纖維廠);K-1000 FIA型流動注射分析儀(日本HITACHI公司);pHS-3B型酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

蘆丁、山奈酚、芹菜素、槲皮素(>98%,陜西慧科植物開發(fā)有限公司);益母草樣品(蘭州盤旋路藥房,甘肅蘭州);實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水;實(shí)驗(yàn)所用溶液均經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾并超聲脫氣。

新毛細(xì)管依次用水(10 min)，0.1 mol/L NaOH(30 min)，水(10 min)沖洗;測定間隔依次用水、0.1 mol/L NaOH、水、運(yùn)行緩沖液沖洗3，5，3，3 min;陽極進(jìn)樣,陰極檢測;檢測波長214 nm。

1.2標(biāo)準(zhǔn)及樣品溶液配制

準(zhǔn)確稱取蘆丁、山奈酚、芹菜素、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品,用乙醇溶解并定容配成1.0mg/mL儲備液,4℃保存?zhèn)溆?使用時用乙醇稀釋至相應(yīng)濃度進(jìn)行電泳分析。稱取5.0 g研碎的益母草樣品于250 mL圓底燒瓶中,加入100 mL乙醇,微沸提取1 h。提取液冷卻后過濾,濾液經(jīng)減壓蒸餾濃縮后用乙醇定容至10 mL,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2　結(jié)果與討論

2.1分離條件

2.1.1緩沖溶液種類運(yùn)行緩沖溶液對電滲流、分析物的遷移時間和分離效率有顯著影響。實(shí)驗(yàn)考察了毛細(xì)管電泳中常用緩沖體系(硼砂體系、磷酸鹽體系、硼砂—NaH2PO4體系)對分離的影響。結(jié)果表明,使用硼砂—NaH2PO4體系時分析物的分離效果最好,因此選擇硼砂—NaH2PO4溶液作為運(yùn)行緩沖溶液。

2.1.2緩沖溶液pH緩沖溶液pH能夠影響電滲流及分析物的解離度,從而影響分離選擇性和靈敏度。實(shí)驗(yàn)在pH 8.0～9.5范圍內(nèi)考察了緩沖溶液pH對分離效果的影響。結(jié)果表明,緩沖溶液pH<8.9時,4種分析物未能完全分離;緩沖溶液pH>8.9時,出峰時間變長、峰形變差且靈敏度降低。綜合考慮，分離度、分析時間和靈敏度,選擇pH 8.9為緩沖溶液最佳pH。

2.1.3硼砂濃度緩沖溶液濃度影響分離體系的離子強(qiáng)度,從而影響電滲流及分離效率。實(shí)驗(yàn)保持硼砂和NaH2PO4的濃度比為1∶2(mmol/L),在5～10 mmol/L范圍內(nèi)研究了硼砂濃度對分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),分離度和遷移時間均隨硼砂濃度的增加而增加。當(dāng)硼砂濃度為8 mmol/L時,標(biāo)準(zhǔn)混合液及樣品中的分析物均能與其他組分完全分離;增大硼砂濃度,隨之增加的焦耳熱使得分離度減小,靈敏度降低。綜合考慮分析時間、分離度和靈敏度,8 mmol/L為硼砂的最佳濃度。

2.1.4有機(jī)添加劑緩沖溶液中加入有機(jī)添加劑可改變分離介質(zhì)的離子強(qiáng)度及黏度,從而改變分離效率。實(shí)驗(yàn)在0～15%(體積分?jǐn)?shù))范圍內(nèi)研究了CH3OH含量對分離的影響。結(jié)果表明,隨著CH3OH含量的增加,分析物出峰時間變長、分離度增大。CH3OH含量為10%(體積分?jǐn)?shù))時,樣品中的分析物可與其他組分完全分離;繼續(xù)增大CH3OH含量,峰形變差,靈敏度降低。綜合考慮分析時間和分離度,選擇10%(體積分?jǐn)?shù))為CH3OH的最佳含量。

2.1.5分離電壓毛細(xì)管電泳中,分離電壓是分離效率的重要影響因素。實(shí)驗(yàn)在8.0～10.0 kV范圍內(nèi)考察了分離電壓的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著分離電壓的增大,遷移時間及分離度均減小,當(dāng)分離電壓大于9.5 kV時,樣品中的待測物未能與其他組分實(shí)現(xiàn)基線分離。綜合考慮分析時間及分離效率,9.5 kV被選擇為最佳分離電壓。

2.1.6充樣時間和注射時間實(shí)驗(yàn)選擇體積為20 μL的樣品環(huán)及試劑環(huán),考察了充樣時間在1～5 s,注射時間在3～11 s范圍內(nèi)變化對分離效果的影響。結(jié)果表明,樣品環(huán)及試劑環(huán)只需3 s即可充滿,故選擇3 s為最佳充樣時間;隨著注射時間的增加,靈敏度不斷提高,當(dāng)注射時間超過9 s時,峰形展寬,分離度降低,故選擇9 s為最佳注射時間。

2.1.7載液流速在FI-CE體系中,載液流速決定了樣品區(qū)帶通過毛細(xì)管口的時間,對分離選擇性和靈敏度具有顯著影響[12]。實(shí)驗(yàn)在0.6～1.4 mL/min范圍內(nèi)考察了載液流速對分離的影響。結(jié)果顯示,靈敏度隨載液流速的增大先升高后降低,流速較低時,峰形展寬。綜合考慮，靈敏度和峰形,選擇1.0 mL/min為最佳載液流速。

2.2FI-CE體系分析性能

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,蘆丁、山奈酚、芹菜素和槲皮素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限如表1所示。結(jié)果表明,回歸方程線性良好,檢出限(S/N=3)為1.95～2.59 μg/mL。

表1　4種黃酮的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限

注：①y為分析物峰面積(mV·s);x為分析物濃度(μg/mL)。

2.2.2精密度在最佳條件下,將250 μg/mL蘆丁、山奈酚、芹菜素和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液每隔4min進(jìn)樣,重復(fù)進(jìn)樣6次(進(jìn)樣頻率為15 h-1),電泳譜圖如圖1所示。用遷移時間和峰面積的日內(nèi)及日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)對方法的精密度進(jìn)行考查,結(jié)果如表2所示，4種化合物的RSD均小于4.16%。

1. 蘆丁;2. 山奈酚;3. 芹菜素;4. 槲皮素條件:熔融石英毛細(xì)管(30.0 cm×75 μm,有效長度26.7 cm);8 mmol/L 硼砂-16 mmol/L NaH2PO4-10%(V/V)CH3OH(pH 8.9)緩沖體系;分離電壓:9.5 kV;檢測波長:214 nm;充樣時間:3 s;注射時間:9 s;載液流速:1.0 mL/min。圖1　標(biāo)準(zhǔn)混合溶液連續(xù)6次進(jìn)樣電泳譜圖Fig.1　Electrochromatogram of standard mixed solution through six consecutive sampling

化合物RSD/% 遷移時間 峰面積 日內(nèi)日間日內(nèi)日間蘆丁0.281.641.991.53山奈酚0.221.074.103.74芹菜素0.160.964.161.05槲皮素0.181.443.282.22

2.3樣品分析

為考察方法的實(shí)用性,用所建立的FI—CE方法對實(shí)際樣品益母草中的蘆丁、山奈酚、芹菜素和槲皮素的含量進(jìn)行測定,益母草的電泳譜圖和實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果分別如圖2及表3所示。結(jié)果表明，4種分析物的回收率為95%～104.3%,RSD均小于2.8%。

1. 蘆丁;2. 山奈酚;3. 芹菜素;4. 槲皮素條件:同圖1所述。圖2　益母草電泳譜圖Fig.2　Electropherogram of Leonurus japonicus

化合物 樣品分析 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 測定值/(mg·g-1)加入值/(μg·mL-1)測得值/(μg·mL-1)回收率/%RSD/%209.3210.0100.32.51蘆丁1.214279.1265.295.0348.9332.495.3211.8204.196.42.80山奈酚0.282282.4287.9101.9353.1338.195.834.235.5103.82.60芹菜素0.22245.645.299.157.055.797.760.060.4100.71.50槲皮素0.08080.082.8103.5100.0104.3104.3

3　結(jié)　論

本文建立了一種測定益母草中蘆丁、山奈酚、芹菜素和槲皮素等4種黃酮類化合物的FI-CE新方法。此方法可在不間斷高壓的情況下連續(xù)進(jìn)樣,有效縮短分析時間并提高方法的精密度和準(zhǔn)確度,具有簡單、高效等特點(diǎn),可用于天然藥物中黃酮類化合物的含量測定及相關(guān)藥物的質(zhì)量監(jiān)控。

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(編輯陳鐿文)

Determination of four flavonoids inLeonurusjaponicasby flow injection-capillary electrophoresis

ZHANG Jing-shu, YU Li-li

(College of pharmacy, Xi′an Medical University, Xi′an 710021， China)

A new method was developed based on flow injection-capillary electrophoresis technique to determine rutin, kaempferol, apigenin and quercetin. Multiple factors affecting separation such as the running buffer type, buffer pH, buffer concentration, the content of organic additive, separation voltage, the flow-rate of carrier solution, charging time and injecting time have been investigated. Four analytes were well separated from each other in 9 min under optimal conditions. The regression equations have excellent linearity. Correlation coefficients ranged from 0.999 0 to 0.999 8 and limits of detection ranged from 1.95 to 2.59 μg/mL. The relative standard deviations of migration time and peak area for intra-day and inter-day analysis were less than 1.64% and 4.16%, respectively. Applied to determine rutin, kaempferol, apigenin and quercetin inLeonurusjaponicasreal sample and the recoveries obtained were in the range of 95%～104.3%.

capillary electrophoresis; flow injection;Leonurusjaponicus; flavonoids

2015-11-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302706)

張靜姝,女,陜西靖邊人,從事分析化學(xué)研究。

O657.8

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-03-014