袁晃堆　葉立新　姚月玲　方運勇　黃小玲　張玉瓊　肖燕青

[摘要]目的探討串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在東莞地區(qū)篩查先天性遺傳代謝病的應(yīng)用價值，為先天性遺傳代謝病的臨床診斷提供實驗室依據(jù)。方法采用干血滴濾紙片法將患兒血液標(biāo)本滴于采血紙片形成血斑，自然風(fēng)干后應(yīng)用APl3200串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。結(jié)果在1206例遺傳代謝病高危兒的檢測中，篩查出高瓜氨酸血癥12例，Citrin缺陷病4例，丙酸血癥4例，戊二酸血癥2例，高精氨酸血癥3例，脂肪酸代謝異常6例（其中短鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥2例，中短鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥1例，極長鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥1例，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶一Ⅱ缺乏癥1例多種酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥1例），多種氨基酸代謝異常癥2例，尿素循環(huán)障礙癥2例，同型半胱氨酸尿癥1例，高甲硫胺酸血癥5例，苯丙酮尿癥5例，高苯丙氨酸血癥5例。結(jié)論串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有高效快捷并可實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化自動化操作等優(yōu)點，在先天性遺傳代謝病早期診斷方面有重要應(yīng)用價值。

[關(guān)鍵詞]串聯(lián)質(zhì)譜；遺傳代謝??；篩查；東莞地區(qū)

[中圖分類號]R722.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]B

[文章編號]2095-0616（2016）03-167-04

遺傳代謝病，又稱先天性代謝異常（inbornerrors of metabolism，IEM），是指由于基因突變引起機體各類的缺陷或功能異常，使機體生化代謝發(fā)生改變，從而出現(xiàn)一系列相對應(yīng)的機體生理變化和臨床癥狀。近年來，隨著人民生活水平的提高和醫(yī)

[基金項目]廣東省東莞市科技計劃項目（2012105150130266）。學(xué)科技的日益發(fā)展，很多非遺傳因素造成的疾病得到了控制，而遺傳因素在疾病構(gòu)成中則日益突出。因此，解決先天性遺傳代謝病高?；純旱膯栴}不容忽視。傳統(tǒng)的IEM檢測方法（如Guthrie細(xì)菌抑制法、放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗等）都屬于“一種試驗檢測一種疾病”。自1990年Millington等首次將串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于新生兒遺傳病篩查以來，經(jīng)過20多年的發(fā)展，串聯(lián)質(zhì)譜已經(jīng)發(fā)展成為IEM篩查診斷中最理想的朝陽技術(shù)。利用高靈敏性、高特異性和快速檢測的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，能在2min內(nèi)通過同時測定同一生物樣品中多種目標(biāo)代謝物，實現(xiàn)一次實驗即可檢測出包括因氨基酸、有機酸代謝紊亂、脂肪酸氧化缺陷而導(dǎo)致的數(shù)十種遺傳代謝性疾病。將串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于遺傳代謝病的篩查，有助于IEM的早期診斷和治療。本研究應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對東莞市2011年9月～2014年12月的1206例IEM高?；純哼M(jìn)行了篩查，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1一般資料

2011年9月～2014年12月來東莞市婦幼保健院進(jìn)行IEM檢查的疑似患兒共1206例，其中男829例，女377例，年齡為1d～12歲，中位年齡2.5歲。疑似IEM患兒具體表現(xiàn)為早產(chǎn)兒黃疸、心功能不全、腦功能障礙、肝內(nèi)膽汁淤積、反復(fù)嘔吐、高乳酸、低血糖、智障、腦癱及器官功能損傷等。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本采集標(biāo)本采集采用干血滴濾紙片法，采血部位可以是指端、足跟及耳垂。具體方法為：將患兒血標(biāo)本滴于采血紙片形成一個或數(shù)個均勻血斑，自然風(fēng)干后上機檢測。

1.2.2標(biāo)本保存標(biāo)本如不能及時檢測應(yīng)密封_于20°C冰箱中待檢。

1.2.3儀器

采用美國生物應(yīng)用系統(tǒng)公司（Applied Biosysterms）的APl3200串聯(lián)質(zhì)譜儀。

1.2.4試劑、材料鹽酸正丁醇（3mol/L）由正丁醇和乙酰氯按9：1配制。氮氣純度為99.999%。96孔聚丙烯板，96孔過濾板（濾膜孔徑0.45um）。甲醇、正丁醇、乙酰氯、乙腈等純度均為高效液相色譜級。以上試劑及材料均購自德國Merck Millipore公司。

1.3測足方法

1.3.1樣品處理采用足跟或指端采血，滴于濾紙使之形成直徑>lcm的血斑，用打孔器將血斑制成直徑3mm的圓形濾紙血片，置于96孔過濾板中，每孔加入100uL含氨基酸和酰基肉堿同位素內(nèi)標(biāo)液的甲醇，室溫放置20min，然后離心至另一個96孔聚丙烯板，50°C加熱吹干，再加入60uL鹽酸正丁醇（3mol/L），Teflon膜覆蓋，置65℃恒溫箱內(nèi)15min，隨后50℃加熱吹干，再加入80%乙腈100uL溶解，鋁膜覆蓋，即可上樣檢測。

1.3.2資料分析數(shù)據(jù)分析采用美國生物應(yīng)用系統(tǒng)公司分析軟件Chemo View 2.0。根據(jù)已知濃度的同位素內(nèi)標(biāo)和各種丁酯化的氨基酸和?；鈮A的離子峰強度，儀器可自動計算出所測樣品中氨基酸和?；鈮A的濃度，然后進(jìn)行臨床分析。

1.3.3質(zhì)量控制

凡是第一次檢鋇IEM得兒童顯示陽性異常，排除了人工誤差和實驗室誤差之后，再用原血片重新檢測一遍，如果2次IEM篩查的結(jié)果都超出了參考值范圍，那該標(biāo)本的IEM檢測結(jié)果為陽性。本院新生兒疾病篩查中心參加了美國疾病控制中心專項質(zhì)量保證和定期進(jìn)行實驗室間的實驗比對。串聯(lián)質(zhì)譜儀操作人員、數(shù)據(jù)分析人員及診療人員曾多次到廣州婦女兒童醫(yī)療中心進(jìn)行專項培訓(xùn)進(jìn)修，保證了串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果的準(zhǔn)確性，保證了IEM疾病診斷分析的可信性，治療的規(guī)范性。

2.結(jié)果

2.1檢測陽性病例

檢測疑似遺傳代謝病高?；純貉?206份，診斷遺傳代謝病12種51例，檢出率為4.23%。篩查出的遺傳代謝病依次為：A，高瓜氨酸血癥12例；B.Citrin缺陷病4例；c.丙酸血癥4例；D.戊二酸血癥2例；E.高精氨酸血癥3例；F.脂肪酸代謝異常6例（其中已知濃度，中短鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥1例，極長鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥1例，多種?；o酶A脫氫酶缺乏癥1例，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-II缺乏癥1例）；G.多種氨基酸代謝異常2例；H.尿素循環(huán)障礙2例；I.同型半胱氨酸尿癥1例；J.高甲硫胺酸血癥5例；K.苯丙酮尿癥5例；L高苯丙氨酸血癥5例。

2.2臨床資料及臨床表現(xiàn)

2.2.1發(fā)病年齡51例陽性病例中新生兒時期發(fā)病21例（41.18%），1～12月發(fā)病18例（35.29%），2～4歲發(fā)病8例（15.69%），>4歲發(fā)病4例（7.84%）。

2.2.2臨床表現(xiàn)29例患兒腦功能障礙；14例早產(chǎn)兒黃疸、抽搐、昏迷；41例患兒喂養(yǎng)困難，出現(xiàn)反復(fù)嘔吐或慢性遷延性腹瀉的情況；5例患兒心力衰竭或心跳驟停（2例有易驚癥狀）；31例患兒肝脾腫大或肝硬變；26例患兒分別皮膚粗糙、干裂、脫皮且久治不愈以及伴有聽力障礙或視神經(jīng)萎縮、唇裂等器官發(fā)育畸形。見表1。3討論

IEM的早期診斷對國民的健康保障重視程度息息相關(guān)，是衡量一個國家醫(yī)學(xué)發(fā)展水平的重要指標(biāo)。國家政府目前已將“提高出生人口素質(zhì)、減少出生缺陷、優(yōu)生促進(jìn)工程”作為近期的人口國策。國內(nèi)由于社會經(jīng)濟(jì)水平和醫(yī)療水平的制約，串聯(lián)質(zhì)譜的技術(shù)與國外相比還不是非常完善和成熟。但是近年國內(nèi)很多發(fā)達(dá)地區(qū)已陸續(xù)開展了串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于IEM的實驗診斷，使我們的技術(shù)愈加成熟與完善，串聯(lián)質(zhì)譜檢測已經(jīng)成為篩查和診斷IEM的常規(guī)手段。

本文研究結(jié)果顯示，東莞地區(qū)IEM檢出率是4.23%（51/120 6），在病種分類中主要以氨基酸代謝異常及脂肪酸代謝異常為主，臨床癥狀包括喂養(yǎng)困難、腦功能障礙、黃疸、心功能不全及相關(guān)畸形等。本研究就陽性率及病種分類均與鄰近的惠州鐘婉秀報道的4.07%（11/270）及主要病種為氨基酸代謝異常的結(jié)果接近，可能的原因是東莞市與惠州市外來人口眾多，分別占總?cè)丝跀?shù)量的77%及27%，人群比較混雜，所以發(fā)病率與其他地區(qū)也有所差別。本研究存在的問題是陽性病例偏少，且未能對所檢測的患兒進(jìn)行縱向的追蹤觀察。目前國內(nèi)各地如廣東廣州、陜西西安、廣西南寧、山東濰坊及福建泉州等地區(qū)報道的結(jié)果顯示其檢出率相差甚遠(yuǎn)，陽性率從1.0%～10.3%，而其病種構(gòu)成比例則比較相近，以氨基酸及脂肪酸代謝異常為主，但臨床癥狀表現(xiàn)復(fù)雜，且與其病種構(gòu)成并無直接聯(lián)系。綜上IEM檢出率相差甚遠(yuǎn)顯示出其發(fā)病率有很強的地域性，是否因地區(qū)、民族不同造成檢出率的差異尚需進(jìn)一步研究。由于各地報道的結(jié)果中存在所檢測的樣本數(shù)及樣本篩選標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，普遍存在檢測標(biāo)本量及檢出的病例過少的問題，造成各地區(qū)統(tǒng)計的陽性率可比性不高，這也是各地相關(guān)醫(yī)療工作者在統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)時應(yīng)該關(guān)注的實際問題。

目前國內(nèi)不少地區(qū)已在逐步開展串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在IEM中的應(yīng)用，隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)不斷成熟及經(jīng)濟(jì)實力不斷發(fā)展，相信IEM的治療會全面普及和標(biāo)準(zhǔn)化，讓IEM患兒得到早期診斷和及時治療，從而避免或減輕疾病的危害。