肖 邦， 李 莉， 余琛琳， 趙善民， 林麗芳， 楊文靜， 叢 薇， 崔淑芳（. 第二軍醫(yī)大學實驗動物中心， 上海 00433； . 第二軍醫(yī)大學教學保障處， 上海 00433）

氯化鈷誘導(dǎo)低氧對裸鼴鼠肝星形細胞增殖及凋亡的影響

肖 邦1， 李 莉2， 余琛琳1， 趙善民1， 林麗芳1， 楊文靜1， 叢 薇1， 崔淑芳1
（1. 第二軍醫(yī)大學實驗動物中心， 上海 200433； 2. 第二軍醫(yī)大學教學保障處， 上海 200433）

目的 比較研究氯化鈷（CoCl2）對裸鼴鼠及C57BL/6J小鼠肝星形細胞增殖和凋亡的影響。方法 采用活細胞計數(shù)試劑盒（CCK8）法和流式細胞術(shù)分別檢測不同濃度CoCl2對裸鼴鼠和小鼠肝星形細胞增殖活力以及和凋亡水平的影響。采用蛋白印跡測定CoCl2處理后裸鼴鼠肝星形細胞低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）和凋亡相關(guān)蛋白（BCL2、BAX）的表達水平。結(jié)果 低濃度（50 μmol/L）CoCl2對C57BL/6j小鼠肝星形細胞增殖活性具有明顯的抑制作用，并能顯著提高其凋亡率，然而同樣劑量的CoCl2能夠顯著提高裸鼴鼠肝星形細胞的增值活性，對細胞凋亡率亦無明顯影響。高劑量CoCl2（＞200 μmol/L）雖能導(dǎo)致裸鼴鼠肝星形細胞增殖活力的降低，及凋亡率的升高，但裸鼴鼠肝星形細胞的變化幅度明顯小于小鼠。同時CoCl2處理后，裸鼴鼠肝星形細胞HIF-1α的表達或累積顯著升高（P＜0.05），BCL2/BAX比率顯著上調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論 與C57BL/6J小鼠相比，裸鼴鼠肝星形細胞具有更強的抵抗CoCl2引起的化學性低氧損傷的能力。同時HIF-1α可能參與調(diào)控裸鼴鼠抵抗化學性低氧環(huán)境造成的損傷。

氯化鈷（CoCl2）； 裸鼴鼠； 肝星形細胞； 凋亡

裸鼴鼠（Heterocephalus glaber）， 屬于濱鼠科， 是生活在非洲肯尼亞、埃塞俄比亞、索馬里等地區(qū)地下環(huán)境的一種嚙齒類動物。由于洞穴環(huán)境中氣體交換極不順暢， 而且真社會化的生存方式使得大多數(shù)的裸鼴鼠生存在極其狹小的空間內(nèi)， 導(dǎo)致氧氣供應(yīng)缺乏， 繼而形成了一種低氧、高CO2的生存環(huán)境［1，2］。然而， 裸鼴鼠在這種極其惡劣的生存環(huán)境中卻能保持身體健康， 壽命高達30年， 超過其他任何同體積的嚙齒類動物［3，4］。因此， 這個物種對低氧環(huán)境具有極強的耐受力， 是研究耐低氧機制的天然的動物模型。前期研究［5，6］表明， 與其他生活在常氧環(huán)境的哺乳類動物相比， 裸鼴鼠在其生物進化的進程中逐漸掌握了一種使其機體有效地應(yīng)對周圍低氧環(huán)境的策略， 例如，裸鼴鼠可以通過降低其基礎(chǔ)代謝率來有效地適應(yīng)低氧環(huán)境。而與潛水類哺乳動物相似，裸鼴鼠也通過形態(tài)學和生理學的適應(yīng)性改變更加適應(yīng)周圍的低氧環(huán)境。

氯化鈷（CoCl2）是一種人工合成的化合物，常用于模擬化學低氧環(huán)境，建立低氧損傷模型，對于低氧性疾病發(fā)病機制的研究具有重要意義［8］。CoCl2模擬化學性低氧環(huán)境的主要機制是鈷離子可以置換感受器含鐵血紅蛋白的Fe2+，降低氧氣的親和力，從而造成缺氧環(huán)境［9］。前期研究［10，11］表明，組織低氧最重要和直接的表現(xiàn)為低氧誘導(dǎo)因子1α （HIF-1α）表達水平顯著性上調(diào)。在低氧應(yīng)激過程中，HIF-1通過結(jié)合到靶基因的啟動子上，進而激活下游基因的表達， 啟動一系列生理生化應(yīng)激反應(yīng)，減少或消除氧氣缺乏給機體帶來的不利影響。在CoCl2模擬低氧性損傷的過程中， 機體通過抑制哺乳類動物最重要的氧平衡調(diào)節(jié)因子 HIF-1α的降解可能是其減少或消除低氧損傷的一種保護機制。

本試驗比較研究了不同濃度CoCl2化合物對裸鼴鼠和小鼠肝星形細胞增殖活性及凋亡率的影響，初步闡釋裸鼴鼠耐低氧的主要調(diào)節(jié)機制，為低氧性損傷疾病的防治提供新線索。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及培養(yǎng)

參照相關(guān)文獻報道的實驗方法分離裸鼴鼠及小鼠肝星形細胞［12］。原代肝星形細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL盤尼西林和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件設(shè)定為體積分數(shù)3%O2、5%CO2、92%N2。實驗過程中，所有用于實驗的細胞都為5～15代的細胞。

1.2 儀器及試劑

主要儀器有超凈工作臺、三氣培養(yǎng)箱、流式細胞儀、高速低溫離心機、恒溫干燥箱、分光光度計等。主要試劑有CoCl2（Sigma， 美國）、DMEM培養(yǎng)基（Sigma， 美國）、CCK8細胞增殖活性檢測試劑盒（Signalway antibody， 美國）、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（Signalway antibody，美國）、抗HIF-1α一抗（Signalway antibody，美國）、抗BAX一抗（Signalway antibody，美國）、抗BCL2一抗（Abcam，英國）、HRP標記抗Actin抗體（Sigma，美國）、預(yù)染蛋白maker（Sigma，美國）。

1.3 活細胞計數(shù)試劑盒（CCK8）法檢測細胞增殖活性

裸鼴鼠及小鼠肝臟星形細胞以1×105/mL的密度接種于96孔板， 每孔體積100 μL， 細胞生長到70%～80%的匯合程度時， 棄去原培養(yǎng)基， 加入100 μL含不同濃度CoCl2［0 μmol/L（對照組）、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L］的培養(yǎng)基， 繼續(xù)培養(yǎng)不同時間（12 h、24 h、48 h），在指定的時間點加入10 μL CCK8溶液，37 ℃孵育1 h，分光光度計測定吸光值。

1.4 細胞凋亡水平分析

裸鼴鼠及小鼠肝星形細胞以1×105個/mL的密度接種于6孔板。在體積分數(shù)3%O2條件下，細胞生長到每孔面積60%～70%的匯合程度時，棄去原培養(yǎng)基， 加入2 000 μL含不同濃度CoCl2［0 μmol/L（對照組）、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、 200 μmol/L、250 μmol/L］的培養(yǎng)基， 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化細胞， 冰預(yù)冷PBS洗滌細胞兩遍， 最后用含5 μL膜聯(lián)蛋白V（annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）和5 μL碘化丙腚（PI）的300 μL孵育緩沖液重懸細胞， 37 ℃， 避光孵育30 min， 流式細胞儀檢測細胞凋亡率。早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞分別表現(xiàn)為PI陰性、annexin V陽性和PI陽性、annexin V陽性。

1.5 蛋白印跡分析

裸鼴鼠肝星形細胞以1×105個/mL的密度接種于6孔板，設(shè)置培養(yǎng)條件為體積分數(shù)3%O2、5%CO2、92%N2，細胞生長到70%～80%的匯合程度時，棄去原培養(yǎng)基，加入2 000 μL含不同濃度CoCl2［0 μmol/L（對照組）、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L］的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在設(shè)定的時間點用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解液裂解細胞， 提取細胞總蛋白。蛋白經(jīng)聚丙烯酰氨凝膠電泳分離（90 V，30 min， 120 V， 60 min）， 然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜（300 mA，90 min）。5%脫脂牛奶封閉過夜，抗HIF-1α （1∶1 000）、抗BAX一抗（1∶1 000）、抗BCL2一抗（1∶1 000）、HRP標記Actin抗體（1∶2 000），4 ℃孵育2 h， 5%脫脂奶粉封閉液稀釋的二抗孵育1 h，Kodak Gel Logic 4000 R成像系統(tǒng)（Carestream，美國）拍照。β-actin 作為內(nèi)參對照，使得組間比較具備科學性。

1.6 統(tǒng)計分析

使用統(tǒng)計軟件SPSS17.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，除特殊表述外，所有實驗數(shù)據(jù)或結(jié)果均經(jīng)過3次獨立重復(fù)試驗。平均值比較采用最小差異（LSD）t檢驗。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CoCl2對裸鼴鼠及小鼠肝星形細胞增殖活性的影響

結(jié)果顯示， 不同濃度CoCl2處理不同時間（12 h、24 h、48 h）后，小鼠肝星形細胞增殖活性顯著降低（P＜0.05）（圖1A），這表明CoCl2對小鼠肝星形細胞增殖活性具有抑制作用，但這種抑制作用不具有濃度或時間依賴性。然而，低濃度（＜100 μmol/L）CoCl2處理后， 裸鼴鼠肝星形細胞增殖活性顯著上升（P＜0.05），而高濃度（＞200 μmol/L）CoCl2處理對裸鼴鼠肝星形細胞增殖活性產(chǎn)生顯著抑制作用（圖1B），這提示，低濃度CoCl2增強裸鼴鼠肝星形細胞增殖活性，而高濃度CoCl2抑制其增殖活性。

2.2 CoCl2對裸鼴鼠及小鼠肝星形細胞凋亡率的影響

CoCl2處理24 h后， 50 μmol/L濃度組與對照組相比， 小鼠肝星形細胞總凋亡率顯著上升（P＜0.05）， 而隨著CoCl2濃度的上升， 小鼠肝星形細胞總凋亡率上升不顯著（圖2A、C）， 這與CoCl2對其增殖活性的抑制作用不具有濃度依賴性相符。然而， 與對照組相比， 不同濃度處理裸鼴鼠肝星形細胞24 h后， 其細胞總凋亡率發(fā)生少量上調(diào)（圖2B、D）（P＞0.05）。

圖 1 CCK8檢測CoCl

圖 2 CoCl2處理24 h后裸鼴鼠及小鼠肝星形細胞凋亡水平

2.3CoCl2對裸鼴鼠肝星形細胞HIF-1α和凋亡相關(guān)蛋白的影響

CoCl2（100 μmol/L）處理裸鼴鼠肝星形細胞24 h后，HIF-1α的表達或累積顯著上升（P＜0.05），CoCl2（150 μmol/L、200 μmol/L）處理組HIF-1α的表達或累積與對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）（圖3A、B）。不同濃度CoCl2處理24 h后，與對照組相比，裸鼴鼠肝星形細胞中BCL2/BAX比率顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖3A、C）。

圖 3 CoCl2處理24 h后裸鼴鼠肝星形細胞HIF-1α和凋亡相關(guān)蛋白水平

3 討論

氧缺乏能夠誘導(dǎo)一系列的細胞學、生理學及分子生物學變化，進而改變細胞的正常增殖、凋亡及損傷修復(fù)等進程［13］。因而， 腦缺血癥常會造成大腦無法修復(fù)的急性損傷。人在缺氧環(huán)境中幾分鐘之內(nèi)就會喪失意識［14］。而在一些哺乳類動物， 它們卻可以長時間耐受周圍環(huán)境性低氧。例如， 裸鼴鼠，與其他地上生活的哺乳類相比， 它通過形態(tài)學和生理學的適應(yīng)性改變適應(yīng)周圍的低氧環(huán)境［15］。然而， 裸鼴鼠長時間耐受低氧環(huán)境的分子機制還不甚明了。

本實驗中，采用藥物CoCl2模擬化學性低氧環(huán)境，比較研究CoCl2對裸鼴鼠和小鼠肝星形細胞增殖活性及凋亡率的影響。實驗結(jié)果顯示，低濃度（50 μmol/L）CoCl2對小鼠肝星形細胞增殖活性具有明顯的抑制作用，而且隨著藥物濃度的升高及處理時間的延長，這種抑制作用并未發(fā)生顯著增強，這提示其不具有濃度及時間依賴性。然而，實驗還顯示，低濃度（＜100 μmol/L）CoCl2增強裸鼴鼠肝星形細胞增殖活性，而高濃度（＞200 μmol/L）CoCl2對裸鼴鼠肝星形細胞增殖活性產(chǎn)生顯著抑制作用。這提示，CoCl2處理對裸鼴鼠肝星形細胞的增殖活性具有雙重效應(yīng)。低劑量CoCl2可能對裸鼴鼠肝星形細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生一種微干擾，活化轉(zhuǎn)錄因子或者激酶，增加某些具有細胞保護或者修復(fù)作用蛋白的表達（如生長因子、抗氧化因子、伴侶分子、免疫因子等），進而啟動一系列修復(fù)損傷和維持細胞正常功能的機制。另外，數(shù)據(jù)也顯示， 50 μmol/L濃度CoCl2處理24 h誘導(dǎo)小鼠肝星形細胞凋亡率顯著上升，這與50 μmol/L濃度CoCl2顯著性抑制小鼠肝星形細胞增殖活性結(jié)果一致。然而， 250 μmol/L濃度的CoCl2處理24 h也不能誘導(dǎo)裸鼴鼠肝星形細胞的凋亡率顯著性上升。上述結(jié)果提示，與小鼠相比，裸鼴鼠肝星形細胞具有更強的抵抗CoCl2引起的化學性低氧損傷的能力。

目前的研究數(shù)據(jù)表明，在低氧應(yīng)激過程中，低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）通過結(jié)合到靶基因的啟動子上，進而激活下游基因的表達，啟動一系列生理生化應(yīng)激反應(yīng)，減少或消除氧氣缺乏給機體帶來的不利影響，從而在抵抗低氧環(huán)境過程中發(fā)揮重要作用。本研究中顯示，CoCl2（100 μmol/L）處理24 h誘導(dǎo)裸鼴鼠肝星形細胞HIF-1α顯著上調(diào)。已有研究數(shù)據(jù)表明，模擬低氧誘導(dǎo)或促進HIF-1α的累積增加，而HIF-1α可能具有抗凋亡作用［16］。因此，上述結(jié)果提示，裸鼴鼠肝星形細胞可能通過上調(diào)HIF-1α的表達，進而激活下游靶基因的表達來發(fā)揮抗凋亡作用，從而抵抗化學性低氧環(huán)境。

BCL2家族由抗凋亡成員和促凋亡成員組成，其成員組成一個復(fù)雜而精確的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在調(diào)控細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用［17］。在脊椎動物細胞中，BAX是BCL2家族的一個重要前凋亡蛋白，其與BCL2形成的異二聚體（BCL2/BAX）位于線粒體外膜，參與維持細胞線粒體外膜完整性，有利于細胞存活［18］。本實驗中，CoCl2誘導(dǎo)裸鼴鼠肝星形細胞BCL2/BAX比率顯著上調(diào)，作者推測，裸鼴鼠可能通過上調(diào)BCL2/BAX的表達來維持細胞線粒體外膜的完整性，從而抑制線粒體外膜通透性改變引起的細胞色素C等物質(zhì)釋放的過程，進而抑制細胞的凋亡［19］。進一步的研究表明， 低氧條件下，HIF-1α可以誘導(dǎo)抗凋亡或促凋亡基因的表達，參與調(diào)控細胞周期的進程，從而影響細胞的存活［20］。基于以上實驗數(shù)據(jù)，作者推斷，裸鼴鼠抵抗組織缺氧的一種機制可能是: 首先上調(diào)HIF-1α的表達，HIF-1α進而調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白BCL2/BAX表達的上調(diào)，從而來抑制細胞凋亡的發(fā)生。

實驗結(jié)果表明，與對低氧敏感的小鼠相比，裸鼴鼠肝星形細胞具有更強的抵抗化學性低氧環(huán)境誘導(dǎo)的凋亡的能力。同時，HIF-1α和BCL2/BAX可能在其抗凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

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Influence of Cobalt Chloride Induced Hypoxia on Proliferationand Apoptosis of Hepatic Stellate Cells in Naked Mole Rat

XIAO Bang1， LI Li2， YU Chen-lin， ZHAO Shan-min1， LIN Li-fang1，YANG Wen-jing1， CONG Wei1， CUI Shu-fang1
（1. Laboratory Animal Center； 2. Teaching Guarantee Department，Second Military University， Shanghai 200433， China）

Objective To compare and study the influence of cobalt chloride （CoCl2） on proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells in the naked mole rat and C57BL/6J mouse， and preliminarily investigate the possible mechanism of hypoxic tolerance in naked mole rat. Methods Evaluating the effects of different concentrations of CoCl2on proliferation activity and apoptosis level of hepatic stellate cells in the naked mole rat and mouse by Cell Counting Kit-8 assay （CCK8） and flow cytometry. Detect the expression of hypoxia inducible factor 1α （HIF-1α） and apoptosis-related proteins （BCL2， BAX）of hepatic stellate cells in the naked mole rat after CoCl2treatment by Western blot assay. Results CoCl2significantly inhibited the proliferation and increased the apoptotic rate of hepatic stellate cells in C57BL/6j mice at a low concentration of 50 μmol/L. However， a same dose of CoCl2can significantly improve the proliferation of hepatic stellate cells in the naked mole rat but had no significant effect on its apoptotic rate. While high concentrations of CoCl2（＞ 200 μmol/L） showed a inhibition of proliferation and a rise of apoptotic rate of hepatic stellate cells in naked mole rat and mice， but the CoCl2-induced changes in hepatic stellate cells of the naked mole rat were much smaller than those of mice. Simultaneously， the expression of HIF-1α and the ratio of apoptosis-related proteins （BCL2/BAX） in hepatic stellate cells of the naked mole rat upregulated or accumulated significantly after treating with CoCl2（P＜0.05）. Conclusion Compared with C57BL/6J mice， the naked mole rat hepatic stellate cells had a greater ability of resistance to hypoxic damage caused by CoCl2. It was speculated that HIF-1α may be involved in the regulation of resistance to damage caused by hypoxic environment in naked mole rat.

Cobalt chloride（CoCl2）； Naked mole rat； Hepatic stellate cells； Apoptosis

Q95-33

A

1674-5817（2016）01-0066-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.014

2015-12-14

國家科技支撐計劃課題（2015BAI09B02）、國家自然科學基金（31402028）、上海市科委基金（14140900200， 13140900400）、全軍實驗動物專項課題［SYDW（2014）007］聯(lián)合資助

肖 邦， 男（1989-）， 碩士生。E-mail: xiaobangjinli@163.com

崔淑芳， 教授。E-mail: youngstar_sf@163.com