曹艷萍, 韓瑞芳, 張凌燕

(1.西北政法大學(xué) 公安學(xué)院，陜西 西安　710063；2.西南政法大學(xué) 刑事偵查學(xué)院，重慶　401120)

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·化學(xué)與化學(xué)工程·

血紅蛋白/Nano-Au/氨基硅烷/L-半胱胺酸@普魯士藍修飾電極檢測H2O2

曹艷萍1, 韓瑞芳1, 張凌燕2

(1.西北政法大學(xué) 公安學(xué)院，陜西 西安710063；2.西南政法大學(xué) 刑事偵查學(xué)院，重慶401120)

以自組裝在金電極上的L-半胱胺酸(L-cys)為基底沉積普魯士藍(PB),滴加氨基硅烷(APTES)后固定納米金(Nano-Au),結(jié)合血紅蛋白(HB),利用PB和HB對過氧化氫(H2O2)的催化作用,制備了H2O2傳感器。該修飾電極在H2O2濃度為 4.0×10-8～1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)與電流有線性響應(yīng),線性相關(guān)系數(shù)R=0.998 0。實驗證明，HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB修飾電極顯著提高了傳感器的靈敏度,增強了穩(wěn)定性,拓寬了線性響應(yīng)范圍并降低了檢測下限。

L-半胱胺酸;普魯士藍;氨基硅烷;納米金;過氧化氫

沉積于電極上充當(dāng)電子媒介體的PB具有良好的電活性物質(zhì),己被廣泛地應(yīng)用于各種生物傳感技術(shù)[1-4],但其存在易滲漏的缺點,影響了電極靈敏度及壽命。于是有文獻報道了電聚合鄰苯二胺[5]、殼聚糖[6]、巰基硅烷[7]等保護膜覆蓋于PB外層以防止其滲漏。此外,HB價格低廉、穩(wěn)定性好,且具有類似于過氧化物酶催化還原H2O2的作用[8]。

本文在電極上自組裝一層L-cys,然后電沉積PB于L-cys分子空隙,滴加一層APTES,利用其豐富的氨基固定Nano-Au,最后在Nano-Au上固定一層HB,由此制備的電極具有如下優(yōu)點:①PB摻雜于L-cys與呈網(wǎng)狀的APTES形成的類似蘑菇狀結(jié)構(gòu)內(nèi),有效提高其穩(wěn)定性;②縮合后的巰基硅烷呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),不僅可防止PB滲漏，其富含的氨基可以吸附更多的Nano-Au;③Nano-Au大的比表面積及良好催化性能，可以顯著增加固定的HB的量并增強其催化活性,提高電極響應(yīng)的靈敏度;④PB不僅是良好的電子媒介體,而且具有良好的催化性能，利用PB與HB良好的催化性能共同對H2O2進行電催化,放大了電極的電流響應(yīng)，從而提高了電極的靈敏度。實驗證明該傳感器在H2O2濃度4.0×10-8～ 1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)對電流有線性響應(yīng)。 該傳感器不但制備成本低,而且具有靈敏度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

CHI660A型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司),采用循環(huán)伏安法考察不同修飾電極表面的電化學(xué)特性。該工作站采用的三電極系統(tǒng)為：HB/Nano-Au/APTES/L-cys @PB修飾的金電極為工作電極,鉑絲電極為對電極,飽和甘汞電極為參比電極。測試底液為:25 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH=6.5)。

L-cys (上?？颠_氨基酸廠),APTES，HB，氯金酸，檸檬酸三鈉(Sigma公司,美國),鐵氰化鉀、三氯化鐵(四川化學(xué)試劑廠)。實驗用試劑均為分析純試劑,實驗用水為二次蒸餾水。

1.2電極制備

用納米Al2O3將直徑為2 mm、長約6 cm的裸金圓盤電極拋光成鏡面,用蒸餾水對其進行沖洗,然后用無水乙醇和丙酮各超聲5min后,再用蒸餾水沖洗,最后將金電極放置于室溫并干燥待用。

電極制備參照文獻[8]。將裸電極浸泡在20 mmol/L的L-半胱氨酸飽和溶液中0.5 h后,通過分子自組裝形成一有序單分子修飾層,然后置于2.5 mmol/L K4Fe(CN)6+2.5 mmol/L FeCl3+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L HCl溶液中在+350和-50 mV范圍內(nèi)進行電沉積,滴加1.6 μL縮合的APTES,然后在Nano-Au中浸泡過夜,最后于含0.5mg/mL HB的25 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH=6.5)中浸泡4 h。

2　結(jié)果與討論

2.1HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB修飾電極表征

HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB修飾電極的過程見圖1。圖1b與圖1a相比較,L-cys@PB出現(xiàn)了一對非常明顯的 Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)氧化還原特征峰(見圖1b),這是由于摻雜了電活性物質(zhì)PB后,PB發(fā)生了如下氧化還原反應(yīng)。

Fe4[Fe(CN)6]3+4e-+4K+?K4Fe4[Fe(CN)6]3

當(dāng)不具備導(dǎo)電性能的聚合物APTES作為保護膜滴加于L-cys@PB外層時,由于其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)堵塞了電子運動的部分通路,電流顯著減小(見圖1c)。Nano-Au具有良好的導(dǎo)電能力,當(dāng)其固定在電極上時,通常促進電子傳遞,使電流增加。在本實驗中,APTES/L-cys@PB修飾電極浸泡Nano-Au后,氧化還原峰電流值繼續(xù)減小(見圖1d),這可能是由于帶負電荷的Nano-Au與同樣帶有大量負電荷的PB 之間的強烈的排斥作用產(chǎn)生的[9],當(dāng)組裝了HB后,電極電流顯著繼續(xù)減小(見圖1e)。

(a) L-cys, (b) L-cys@PB； (c) APTES/L-cys@PB；(d)nano-Au/APTES/L-cys@PB； (e)HB/nano-Au/APTES/L-cys@PB. 掃速: 100 mV/s.圖1　循環(huán)伏安對電極制備過程的表征Fig.1　CVs were recorded in a 25 mmol/L PBS (pH 6.5)

由圖2可見,在20～120 mV/s 范圍內(nèi),HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB電極的ipa/ipc=1,即氧化峰與還原峰電流幾乎相等,且氧化峰電流和還原峰電流ip與掃描速率V之間有線性關(guān)系,表明整個電極過程是受表面過程控制[9]。

圖2　掃描速度對HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB修飾電極循環(huán)伏安的影響,掃速分別為:20, 40, 60, 80,100,120,140 mV/sFig.2　CVs of HB/Nano-A/APTES/L-cys@PB-modified electrode in 25 mmol/L PBS (pH 6.5) at various scan rates. The scan rates for curves are 20, 40, 60, 80,100,120 and 140 mV/s, respectively

2.2H2O2在 HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB 修飾電極上的電化學(xué)行為

圖3考查了HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB 修飾電極對H2O2的電催化還原。當(dāng)H2O2濃度分別是0 mol/L,0.50×10-6mol/L,2.30×10-6mol/L時,可以看出，HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB 修飾電極的氧化峰電流明顯減小,還原峰電流顯著增加。這證明HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB 修飾電極對H2O2有良好的電催化還原作用,其反應(yīng)機理如下:

H2O2+CatFe(Ⅲ)→H2O+CatFe(Ⅳ)=O

H2O2+CatFe(Ⅳ)=O→H2O+CatFe(Ⅲ)+

O2

(a) 0mol/L； (b) 0.50×10-6mol/L； (c) 2.30×10-6mol/L,測試底液為25mol/L PBS (pH 6.5)的電催化行為。插圖為計時電流:(25～125 s) 0.18 μmol/L, (125～175s) 0.42 μmol/L, (175～225 s) 1.38 μmol/L圖3　HB/N ano-Au/APTES/L-cys@PB 電極 的電催化響應(yīng):H2 O2濃度Fig.3　Electrocatalytic activity of HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB-coated electrode in 25 mol/L PBS

2.3組裝方法不同的電極電流響應(yīng)特性比較

PB是良好的電活性物質(zhì),對H2O2有良好的電催化還原作用,但在電化學(xué)傳感器研究中,基本上僅將其作為電子媒介體，只有極少數(shù)文獻研究了其催化性能[8]。此外,HB與辣根過氧化物酶對H2O2均有良好的催化還原作用,但后者不僅對保存環(huán)境要求較高，且價格較前者貴,故本實驗采用HB修飾電極。本實驗比較了4種組裝方法修飾的電極對H2O2的循環(huán)伏安電流響應(yīng)曲線(見圖4),分別為HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB(a)，Nano-Au/APTES/L-cys@PB(b)，HB/Nano-Au/APTES/PB(c)，HB/Nano-Au/APTES/L-cys(d)修飾電極對H2O2的循環(huán)伏安電流響應(yīng)曲線。從圖4可見,a，b與c對H2O2均有良好的催化性能,由于固定在電極上的L-cys是有序定向單分子修飾層,而網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)APTES則置于L-cys的外層,故L-cys與APTES構(gòu)成了類似蘑菇網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[8]。PB摻雜并固定在L-cys分子之間,且外層有APTES保護,有效提高了穩(wěn)定性,故圖4中a與b響應(yīng)性能較c好。HB/Nano-Au/APTES/L-cys修飾電極對H2O2幾乎無響應(yīng)。這是由于HB是生物大分子,其電活性物質(zhì)輔基血紅素中的鐵原子被包裹于HB內(nèi)部而未能與電極表面接觸,故不能進行直接的電子傳遞,電極中引入電子媒介體PB后,能夠促進HB與電極表面之間的電子傳遞。此外,PB在本實驗設(shè)計中不僅充當(dāng)電子媒介體,而且對H2O2具有良好的催化活性。實驗證明，HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB 修飾電極對H2O2催化性能最好,其在H2O2濃度為 4.0×10-8～1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)對電流有線性響應(yīng),檢測下線 1.5×10-8mol/L(S/N=3)。這可能是因為PB與HB共同對H2O2催化的結(jié)果。

圖4　H2O2在不同修飾電極的響應(yīng)曲線圖Fig.4　Amperometric response of H2O2 in the different modified electrode(a)HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB； (b)Nano-Au/APTES/L-cys@PB； (c)HB/Nano-Au/APTES/PB； (d)HB/Nano-Au/APTES/L-cys

酶促反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)(kmapp)可由Lineweaver-Burkequation 方程[10]求得:1/Iss=1/Imax+kmapp/ImaxC,其中Iss是加入一定濃度的H2O2時的穩(wěn)態(tài)電流,Imax是H2O2濃度為最大時的電流,C為Iss對應(yīng)的底物的濃度。 米氏常數(shù)(kmapp)可由穩(wěn)態(tài)電流的倒數(shù)和H2O2濃度的倒數(shù)作圖產(chǎn)生的斜率和截距求得。用此方法測得傳感器的kmapp為 0.184 mmol/L, 較低的米氏常數(shù)說明該修飾電極固定的HB有較高的生物活性,且與H2O2有好的親和力。

2.4PB沉積量、APTES滴加量修飾電極對電流響應(yīng)的影響

PB沉積量對電流響應(yīng)有很大影響。在相同條件下,電極上PB量與沉積時間成正比，圖5比較了PB沉積時間分別為(a)15min,(b)20min,(c)25min,(d)30min修飾的HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB 電極對H2O2的催化效果,結(jié)果顯示PB沉積25min時修飾的電極對H2O2的催化效果最好。

APTES滴加量對電極響應(yīng)也會產(chǎn)生很大影響。當(dāng)電極上APTES加量過多時會極大防止PB滲漏,且其豐富氨基將吸附更多Nano-Au,從而可以固定大量的HB。然而,大量的HB將堵塞電子到達電極的通道,反而降低了修飾電極對H2O2的催化作用,故實驗過程中僅滴加1.6 μL APTES。

圖5　PB沉積時間分別為(a) 15min, (b) 20min,(c) 25min, (d) 30min時修飾電極的電流響應(yīng)Fig.5　The current response of the PB deposit time for the modified electrodes:(a) 15min, (b) 20min,(c) 25min, (d) 30min

pH對HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB修飾電極催化反應(yīng)及其活性有重要影響。pH從4.0～7.5范圍內(nèi)的PBS中,固定H2O2濃度,發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH為6.5時,該修飾電極對H2O2催化效果最佳。

2.5電極的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及抗干擾性實驗

為了考察該修飾電極的穩(wěn)定性,將HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB修飾電極放置于測試底液中(不含H2O2)連續(xù)循環(huán)掃描100圈后,發(fā)現(xiàn)該修飾電極的電流響應(yīng)信號仍能保持初始信號的93.1%。這證明該電極組裝方式能夠有效防止PB滲漏,其主要原因是PB摻雜于L-cys后與L-cys之間有較強的黏附作用,能減少PB流失。此外,L-cys@PB與其外層網(wǎng)狀的APTES形成的類似蘑菇狀結(jié)構(gòu),也能夠防止其滲漏,增加其穩(wěn)定性。為了考察該修飾電極的壽命,將該電極放置于2～8℃冰箱中,間歇性使用15天,其響應(yīng)信號的變化量未超過初始信號的5.2%。此外,文獻[11]對電極的制備重現(xiàn)性進行考察,在相同條件下同時制備了4支HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB修飾電極,然后將它們分別置于含0. 2 mmol/L H2O2的測試底液中測定電流響應(yīng)。結(jié)果顯示:4支同時制備的電極其響應(yīng)電流的RSD<4. 2%,此結(jié)果表明該修飾方法制備的電極有良好的制備重現(xiàn)性。

在優(yōu)化后的實驗條件下,將可能的干擾物質(zhì)(濃度為1.0 mmol/L)如抗壞血酸、乳酸、葡萄糖、亞硝酸、尿酸等加入含0.2 mmol/L H2O2的測試底液中進行測試,結(jié)果證明上述物質(zhì)對該修飾電極的測定均無明顯影響。

3　結(jié)　論

本文介紹的HB/Nano-Au/APTES/L-cys@PB修飾電極對H2O2具有良好的催化性能。由于PB摻雜于L-cys分子間,且與APTES形成的類似蘑菇狀結(jié)構(gòu)有效防止PB滲漏,提高了其穩(wěn)定性。 此外,由于PB和HB對H2O2具有催化性能,其協(xié)同作用,顯著提高了電極對H2O2的催化響應(yīng)。

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(編輯陳鐿文)

HB/Nano-Au/APTES/L-cystine@PB modified biosensor for H2O2determination

CAO Yan-ping1, HAN Rui-fang1, ZHANG Ling-yan2

(1.School of Public Security， Northwest University of Politics and Law, Xi′an 710063， China;2.College of Criminal Investigation, Southwest University of political Science and Law, Chongqing 401120， China)

An amperometric biosensor for the detection of H2O2was developed. The system was based on(3-mercaptorpropyl) trime-thoxysilane coat the prussian blue deposited @L-cystine-modified electrode to merge hemoglobin with nano-Au. The biosensor showed a specific response to H2O2in the range 4.0×10-8to 1.0×10-5mol/L by CV. Both prussian blue and hemoglobin exhibited excellent electrocatalytical properties toward the reduction of H2O2to amplify the amperometric signal, which enhanced the sensitivity of the biosensor and stability.

L-cys; PB; APTES; Nano-Au; H2O2

2015-03-11

國家自然科學(xué)基金資助項目(51102200);陜西省教育廳基金資助項目(2013JK0748)

曹艷萍，女，陜西榆林人，教授，從事型事法化及物證技術(shù)研究。

張凌燕，女，湖南長沙人，教授，從事法化及物證技術(shù)研究。

O657.1

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-02-011