張鵬鵬，李增順，湯　鵬，段慧琴，孫英健，穆　祥

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

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赤芍水提物對金黃色葡萄球菌腸毒素及蛋白A表達的影響

張鵬鵬，李增順，湯鵬，段慧琴，孫英健*，穆祥

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

探討了赤芍水提物在體外對金黃色葡萄球菌腸毒素A、B及蛋白A分泌及mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。試驗中采用微量倍比稀釋法測定赤芍對金黃色葡萄球菌ATCC29213的最小抑菌濃度(MIC)；采用Western blot和實時熒光定量PCR檢測亞抑菌濃度下赤芍水提物對金黃色葡萄球菌腸毒素A、B及蛋白A在mRNA轉(zhuǎn)錄和毒素蛋白分泌表達的影響。結(jié)果表明，赤芍水提物對金黃色葡萄球菌ATCC29213的MIC值為6.3 mg/mL；在亞抑菌濃度下，赤芍水提物可以明顯抑制腸毒素A、B及蛋白A在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的表達，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。

赤芍；金黃色葡萄球菌；腸毒素；蛋白A

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)能引起多種動物和人的疾病，其致病性主要依靠菌體分泌的多種毒力因子的作用，包括菌體表面蛋白和胞外蛋白[1]，如纖連蛋白結(jié)合蛋白(fibronectin-binding protein)[2]、蛋白A(Staphylococcusaureusprotein A,SPA)[3]、腸毒素(Staphylococcusaureusenterotoxins,SEs)[4]、溶血素(hemolysin)[5]、毒性休克綜合征毒素-1(toxic shock syndrome toxin 1,TSST-1)[6]等。其中SPA是金黃色葡萄球菌壁表面的一種錨定蛋白，在細菌感染初期能抑制機體的免疫反應(yīng)[3]，促進細菌在宿主細胞上的定殖，是一些包括肺炎、敗血癥等炎癥的直接致病因子，在金黃色葡萄球菌致病過程中起著重要的作用[7]。研究表明將SPA突變型金黃色葡萄球菌靜脈注入小鼠后，小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率、小鼠病死率等都明顯降低[8]。SEs是金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相似、毒力相似、抗原性各異的胞外單鏈小分子蛋白質(zhì)，分A、B、C1、C2、C3、D、E、G和H 9個血清型，具有很高的熱穩(wěn)定性，經(jīng)100℃高溫煮沸30 min仍可保持其生物活性和免疫活性[9]。臨床分離的金黃色葡萄球菌約1/3可產(chǎn)生腸毒素，一般認為攝入約1 μg/kg金黃色葡萄球菌腸毒素即可引起人的中毒，其作用機制可能是到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)后刺激嘔吐中樞而導(dǎo)致以嘔吐為主要癥狀的食物中毒[10-11]。中藥在治療細菌性感染方面具有良好的療效，但其作用機制尚不完全清楚。

赤芍(Radix Paeoniae Rubra,RPR)為毛茛科植物芍藥的干燥根，其作為中醫(yī)治療“血瘀癥”的主要藥物，歷年來廣泛應(yīng)用于臨床治療中。赤芍味苦，性涼，具有行瘀止痛、涼血消腫的功效；主治瘀滯經(jīng)閉、疝瘕積聚、腹痛脅痛、衄血血痢、腸風(fēng)下血、目赤癰腫[12]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，赤芍具有抗過敏、抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用，對痢疾桿菌、葡萄球菌等有抑制作用[13]。本文主要研究赤芍水提物對金黃色葡萄球菌毒力因子SPA、SEA和SEB分泌的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213，鼎國生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2試劑赤芍，北京同仁堂藥店前門店產(chǎn)品；MHB培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；HiFi-MMLV cDNA kit試劑盒和HRP標(biāo)記的二抗，康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SPA和腸毒素A、B抗體，Sigma公司產(chǎn)品；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；ECL發(fā)光液，碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1赤芍水提物制備稱取100 g赤芍研磨粉，水煮至沸25 min，過濾，將藥液濃縮至終濃度為0.2 g/mL。

1.2.2最小抑菌濃度(MIC)的測定采用CLSI(Clinical and Laboratory Stands Institute)推薦的微量稀釋法測定赤芍水提物對金黃色葡萄球菌株的MIC值。

1.2.3實時熒光定量PCR從培養(yǎng)皿中挑取ATCC29213菌落于100 mL MHB培養(yǎng)基中37℃、150 r/min培養(yǎng)至OD 600 nm為0.3，然后給予不同濃度的赤芍水提物繼續(xù)培養(yǎng)6 h。離心收集菌體，菌體經(jīng)金黃色葡萄球菌溶菌酶及溶菌素裂解后采用Trizol法提取細菌總RNA，用HiFi-MMLV cDNA kit試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并置于-20℃?zhèn)溆谩崟r熒光定量PCR所用引物如表1所示。用SYBR Premix ExTaqTM試劑盒進行real-time PCR 擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，退火溫度為55 ℃，其他反應(yīng)條件依據(jù)說明書推薦進行。所有樣品均為3個平行，并以16 S作為內(nèi)參。采用2-△△Ct法分析基因的相對表達水平。

表1　實時熒光定量PCR引物序列

1.2.4Western blot分析分別取經(jīng)離心和濾膜過濾的細菌培養(yǎng)液上清100 μL，加入25 μL 5×Loading buffer，100℃ 10min，取25 μL上樣，進行SDS-PAGE(120 g/L分離膠)，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用50 g/L脫脂牛奶封閉2 h，PBST洗3次每次15 min，分別與金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)抗體(Sigma)(1∶10 000稀釋)、金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)抗體(Sigma)，(1∶10 000稀釋)、金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)抗體(Sigma)(1∶10 000稀釋)孵育，4℃過夜，PBST洗3次,每次15 min，用HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，PBST洗3次，加入ECL發(fā)光液檢測。

2　結(jié)果

2.1赤芍水提物對金黃色葡萄球菌ATCC29213的抑菌活性及其增殖的影響

通過微量倍比稀釋法測定，赤芍水提物對金黃色葡萄球菌ATCC29213的最小抑菌濃度(MIC)為6.3 mg/mL。

我們以1/6、1/5、1/4、1/3、1/2、1、2、3倍的MIC為給藥濃度，測定其對細菌的生長的影響，每2 h記1次細菌懸液的OD 600 nm值。結(jié)果如圖1所示，當(dāng)赤芍濃度小于MIC值時(6.3 mg/mL)，對細菌的增殖幾乎沒有影響，當(dāng)赤芍濃度大于MIC值，則明顯抑制細菌的增殖。

圖1　赤芍水提物對金黃色葡萄球菌增殖的影響Fig.1　Effect of water extracts of Radix Paeoniae Rubra on the proliferation of S.aureus

2.2亞抑菌濃度的赤芍水提物降低金黃色葡萄球菌SPA、SEA、SEB的表達

用含有不同濃度的赤芍水提物的培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌6 h后，用Western blot檢測細菌培養(yǎng)物上清中金黃色葡萄球菌所分泌的SPA、SEA、SEB的含量，結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中赤芍水提物的含量為1 mg/mL時，與不給藥的對照組相比3種毒素的表達量均受到明顯的抑制，當(dāng)赤芍含量為2、4 mg/mL時，其抑制作用進一步加強，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性(圖2)。經(jīng)蛋白條帶灰度分析與不給藥組相比，含赤芍的金葡菌培養(yǎng)物中SPA、SEA和SEB的表達顯著下降(圖2)。

2.3亞抑菌濃度的赤芍水提物抑制金黃色葡萄球菌SPA、SEA基因的轉(zhuǎn)錄

應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測技術(shù)檢測不同濃度的赤芍水提物對金黃色葡萄球菌ATCC29213 SPA和腸毒素A的編碼基因轉(zhuǎn)錄的影響，結(jié)果顯示，在亞抑菌濃度下，SPA、SEA的mRNA表達量均隨藥物濃度的升高而降低(圖3和圖4)。

3　討論

關(guān)于赤芍提取物對金黃色葡萄球菌增殖的影響研究較多，由于中藥具有獨特的道地性，不同實驗室關(guān)于赤芍對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度的測定差異也比較大。在本研究中，赤芍水提物的最小抑菌濃度(MIC)為6.3 mg/mL，與張顯忠等[14]研究的川赤芍水提物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度相近(MIC為3.9 mg/mL)；而新疆赤芍水提物對于金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度則為250 mg/mL[15]。這可能與不同產(chǎn)地的中藥藥效的差異有關(guān)。

A.SPA、SEA和SEB蛋白Western blot檢測結(jié)果；B.SPA、SEA和SEB蛋白灰度分析結(jié)果

A.Western blot analysis of SPA,SEA and SEB；B.The relative density of the bands in the figure A

圖2赤芍水提物對金黃色葡萄球菌的SPA、SEA和SEB表達的影響

Fig.2Effects of Radix Paeoniae Rubra water extracts on the expressions of SPA,SEA,and SEB ofS.aureus

圖3　金黃色葡萄球菌在赤芍水提物作用后 其SPA的mRNA表達水平Fig.3　Effects of Radix Paeoniae Rubra water extracts on SPA mRNA expression of S.aureus

圖4　金黃色葡萄球菌在赤芍水提物作用后 其SEA的mRNA表達水平Fig.4　Effects of Radix Paeoniae Rubra water extracts on the SEA mRNA expression of S.aureus

目前的研究發(fā)現(xiàn)許多中藥都有良好的抗感染效果[16]，部分中藥提取物在亞抑菌濃度下具有抑制細菌毒素表達的作用，例如連翹提取物[17]、厚樸酚[18]、紫蘇油[19]、蜂膠[20]、異土木香內(nèi)酯[21]、甘草茶爾酮E[22]等在亞抑菌濃度能明顯抑制α-溶血素、SEA、SEB、TSST-1等毒素的分泌。本研究發(fā)現(xiàn)赤芍水提物在亞抑菌濃度下可抑制金黃色葡萄球菌毒力因子SPA、SEA、SEB蛋白的表達，同時也可抑制相應(yīng)毒力因子mRNA的轉(zhuǎn)錄，因此推測，赤芍水提物抑制金黃色葡萄球菌毒力因子蛋白的表達是通過抑制相關(guān)毒力因子mRNA轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的。眾所周知，金黃色葡萄球菌的致病作用主要是依賴分泌的毒力因子，SPA是金黃色葡萄球菌在對數(shù)生長期時分泌的毒力因子，在呼吸道上皮細胞中廣泛存在TNF-α的受體TNFR-1也是SPA的受體，細菌在增殖的同時SPA的分泌表達增加，其與宿主體內(nèi)的腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor-1，TNFR-1)結(jié)合，首先在細胞表面通過其胞內(nèi)區(qū)的死亡結(jié)構(gòu)域直接募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域(TNF receptor-associated death domain，TRADD)，TRADD再募集RIP-1和TRAF-2，在細胞膜上形成信號復(fù)合物，進而激活NF-κB信號通路，調(diào)節(jié)多種因子表達，介導(dǎo)炎性反應(yīng)[23-24]，促進肺部炎癥不斷擴大；當(dāng)用SPA突變菌株感染小鼠時，小鼠患肺炎率則明顯降低[25]。SEA和SEB等腸毒素是金黃色葡萄球菌在增殖的平臺期開始分泌的毒素之一，可干擾腸道的正常功能，從而引起腸胃炎或食物中毒[26]。根據(jù)本研究發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度下的赤芍水提物在體外可分別抑制對數(shù)生長期的毒力因子SPA和平臺期的毒力因子SEA、SEB的表達，這提示赤芍在感染初期抑制了細菌SPA蛋白的表達、從而降低SPA與TNFR-1的結(jié)合，抑制了下游信號通路的激活，從而降低炎癥反應(yīng)。

本研究提示，赤芍水提物在亞抑菌濃度下能顯著抑制細菌不同時期毒力因子的分泌表達，這可能正是赤芍抗細菌感染的主要機制。赤芍水提物在亞抑菌濃度下對金黃色葡萄球菌ATCC29213菌株毒力因子蛋白A、腸毒素A、腸毒素B的分泌表達有抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。赤芍在體內(nèi)的的藥理作用仍需進一步的研究。

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Influence of Radix Paeoniae Rubra Water Extract on Expression of Enterotoxins and Protein A ofStaphylococcusaureus

ZHANG Peng-peng,LI Zeng-shun,TANG Peng,DUAN Hui-qin，SUN Ying-jian,MU Xiang

(Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Veterinary Medicine,College of Animal Science and Veterinary Medicine,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing,102206,China)

In the study,we investigated the influence of Radix Paeoniae Rubra water extract on the expression of enterotoxins(SEA，SEB) and SPA ofS.aureus. A broth micro-dilution method was used to determine the minimal inhibitory concentrations (MICs) of Paeoniae Rubra extract toS.aureusstrains (ATCC29213).Western blot and real-time RT-PCR assays were performed to assess the effects of Radix Paeoniae Rubra extract onS.aureusSEA,SEB and SPA expressions.The results showed that the MICs of Radix Paeoniae Rubra extract againstS.aureusstrains were 6.3 mg/mL,Radix Paeoniae Rubra extract can dose-dependently reduce the secretion and transcription of SEA, SEB and SPAS.aureuson the subinhibitory concentrations.

Radix Paeoniae Rubra;Staphylococcusaureus;enterotoxin;protein A

2016-01-06

國家自然科學(xué)青年基金項目(31302137)；北京市自然科學(xué)基金項目(6162006)；2015年北京農(nóng)學(xué)院研究生創(chuàng)新科研項目-自然科學(xué)類(2015YJS045)；北京農(nóng)學(xué)院與北京市農(nóng)委對接項目(2033217008)；北京農(nóng)學(xué)院科技創(chuàng)新團隊科研能力提升工程項目(KCT2014012)

張鵬鵬(1989-)，男，山西人，碩士研究生，主要從事藥理學(xué)研究。*通訊作者

S853.74

A

1007-5038(2016)09-0075-04