張　黎，鄭明學(xué)，鄭龍龍，白　瑞，戴浩楠，史晨婕，貢　鑫，席　柔，蘇曉晴，張李琦，韓克光，徐之勇，楊莎莎

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，山西太谷 030801)

?

過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對枯草桿菌芽胞的殺滅效果評價

張黎，鄭明學(xué)*，鄭龍龍，白瑞，戴浩楠，史晨婕，貢鑫，席柔，蘇曉晴，張李琦，韓克光，徐之勇，楊莎莎

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，山西太谷 030801)

為評價過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對枯草桿菌黑色變種芽胞的殺滅效果，進行懸液定性和懸液定量殺滅試驗。結(jié)果表明，該消毒劑對枯草桿菌黑色變種芽胞的最低有效殺滅濃度為1∶256，最短有效殺滅時間為5 min，在該濃度下作用45 min或濃度1∶64作用7.5 min均可100% 殺滅枯草桿菌芽胞。研究結(jié)果表明，該消毒劑對枯草桿菌黑色變種芽胞有較強的殺滅作用，為其進入臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑；枯草芽胞桿菌黑色變種；芽胞；殺滅效果

近年來，人們對消毒劑的應(yīng)用不斷重視，并獲得了良好的效果[1-2]。過氧化物類消毒劑如過氧乙酸、過氧化氫和臭氧等多用于畜禽欄舍、用具、地面及墻壁等消毒，雖然有很強的殺菌能力、無殘留毒性，但是穩(wěn)定性差、有腐蝕性。因此，研究了一種新的消毒劑，期望能夠在臨床試驗中獲得良好的效果。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物病理學(xué)實驗室依據(jù)過氧乙酸、過氧化氫和戊二醛等常用消毒劑的理化性質(zhì)及其之間的協(xié)同消毒作用[3-4]，研制出了對禽流感病毒有特效作用的消毒劑，且該消毒劑可有效殺滅雞新城疫病毒、雞傳染性法氏囊病病毒和豬瘟病毒等消毒效果指示菌(毒)種[5-6]，但對能否有效殺滅細菌芽胞尚不清楚。

枯草芽胞桿菌黑色變種是芽胞桿菌科芽胞桿菌屬萎縮芽胞桿菌種的一個芽胞桿菌菌株，美國、日本和大多數(shù)歐盟國家和地區(qū)將其列入食品和醫(yī)療衛(wèi)生檢測標準的質(zhì)量控制標準檢測菌株，被廣泛應(yīng)用于多種消毒劑、消毒儀器和方法的消毒效果評價中。在惡劣環(huán)境下，該菌能夠產(chǎn)生有很強抗逆性的芽胞，該芽胞含水量低，有厚而致密的芽胞壁，并含有豐富的耐熱酶，可適應(yīng)各種不良環(huán)境，成為自然界中抗性最強的微生物。因此，研究過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對枯草芽胞桿菌黑色變種的殺滅效果，為本消毒劑的臨床推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗用菌株枯草芽胞桿菌黑色變種(ATCC9372)，購自青島日水生物技術(shù)有限公司，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物病理學(xué)實驗室保存。

1.1.2試劑營養(yǎng)瓊脂，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；BSA，Sigma產(chǎn)品產(chǎn)品；PBS、過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑、中和劑，均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物病理學(xué)實驗室提供。

1.1.2主要儀器設(shè)備0.22 μm濾器，分析天平，-80℃冰箱，pH儀，移液器，超凈工作臺，高壓鍋，恒溫水浴鍋，恒溫培養(yǎng)箱，雙重純水蒸餾器等，均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物病理學(xué)實驗室提供。

1.2方法

1.2.1過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對枯草芽胞桿菌芽胞定性滅菌試驗過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑(專利號：101743971A)由過氧乙酸、過氧化氫、戊二醛、純化水、穩(wěn)定劑和增效劑組成的混合液，本品保存時分為A液和B液，使用時按照A∶B=24∶1混合均勻即時使用。參照參考文獻[7]的方法制備枯草芽胞桿菌芽胞，依據(jù)農(nóng)業(yè)部規(guī)定[8]，用含10 g/L蛋白胨的0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液芽胞懸液稀釋芽胞濃度為5×105CFU/mL～5×106CFU/mL；取10支10.0 mL試管，編號T1～T10，置20℃水浴，依次加入2.5 mL滅菌蒸餾水，取2.5 mL試驗用消毒劑加入T1混勻，T2～T9做倍比(1∶2)稀釋，T10管僅加蒸餾水作為陽性對照組。每管加入2.5 mL菌液后5、10、15、30、60 min時，分別吸取0.5 mL加入4.5 mL中和劑中搖勻，10 min后取0.5 mL加到4.5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，同時設(shè)未處理營養(yǎng)肉湯作為陰性對照組。

將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)24 h，肉湯混濁說明細菌未殺滅，肉湯澄清透明，繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，若仍澄清透亮說明無菌生長。以無菌生長管消毒液的最低濃度為最低殺菌有效濃度，以無菌生長管的最短消毒時間為該濃度殺菌最快有效時間。

1.2.2過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對枯草芽胞桿菌芽胞定量滅菌試驗用0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液將枯草芽胞桿菌芽胞懸液稀釋為5×106CFU/mL～5×107CFU/mL[9]，取過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑2.0 mL備用。

1.2.2.1最低有效殺菌濃度對枯草芽胞桿菌芽胞定量滅菌試驗取11支試管，編號T111-T113、T121-T123、T131-T133、C11和C10，每管中加入0.5 mL菌懸液，0.5 mL BSA(有機干擾物)和4.0 mL相應(yīng)濃度消毒劑(依據(jù)1.2.1確定的濃度)混勻，C11管內(nèi)加0.5 mL菌液，0.5 mL BSA和4.0 mL標準硬水作為陽性對照組，C10管加0.5 mL PBS液、0.5 mL BSA和4.0 mL標準硬水作為陰性對照組。在20℃水浴中分別作用0.5×t(T111-T131)、t(T121-T123)和1.5×t(T131-T133)后，從每管中取0.5 mL液體與4.5 mL中和劑作用10 min，取1.0 mL混合液做營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)，于37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后進行活菌計數(shù)，以陽性對照組菌液濃度作為菌液原有濃度計算殺菌率。

1.2.2.2過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑在最短時間可有效滅菌的最低濃度下對枯草芽胞桿菌芽胞定量滅菌試驗取11支試管，編號T211-T213、T221-T223、T231-T233、C21和C20，每管中加入0.5 mL試驗菌懸液，0.5 mL BSA和4.0 mL相應(yīng)濃度消毒劑(依據(jù)1.2.2.1中5 min內(nèi)有效滅菌的最低濃度)混勻，方法同1.2.2.1。

判斷標準：消毒t時的殺菌率Pt=[(n0-nt/n0)]×100%；n0為t時細菌原有濃度；nt為消毒后活菌數(shù)；殺菌率大于99.9%時，達到消毒效能，殺菌率為100%時，達到殺菌效能。

2　結(jié)果

2.1過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對枯草芽胞桿菌芽胞定性殺滅結(jié)果

消毒劑稀釋1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64倍時，作用5、10、15、30、60 min；稀釋1∶128和1∶256倍時，作用10 min或30 min及以上均可有效殺滅枯草芽胞桿菌芽胞；稀釋1∶512時60 min內(nèi)不能殺滅枯草芽胞桿菌芽胞。本試驗結(jié)果顯示，該消毒劑殺滅枯草芽胞桿菌芽胞的最低有效濃度為1∶256，在此濃度下需最短作用30 min；最短作用時間為5 min，此時的最低濃度為1∶64(表1)。

表1　消毒劑定性殺滅枯草芽胞桿菌芽胞肉湯渾濁度

注：培養(yǎng)基渾濁，即為陽性，以“+”表示；培養(yǎng)基清亮，即為陰性，以“-”表示。

Note：The medium turbidity is positive,expressed as “+”; medium clear is negative,expressed as “-”.

2.2過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對枯草芽胞桿菌芽胞定量殺滅結(jié)果

如表2和表3，相同濃度的該消毒劑對枯草芽胞桿菌芽胞的殺滅率隨作用時間延長而增高，1∶256倍稀釋時作用30 min，殺菌率為99.93%，作用45 min，殺菌率為100%；1∶64倍稀釋時作用5.0 min，殺菌率為99.94%，作用7.5 min，殺菌率為100%。

3　討論

本試驗中采用的過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑殺滅枯草芽胞桿菌芽胞的最低有效濃度為1∶256，在此濃度下作用45 min，殺菌率可達100%；該消毒劑最快殺滅枯草芽胞桿菌芽胞時間為5 min，此時濃度不低于1∶64。本試驗所用中和劑可有效中和完成消毒作用的消毒劑，所采用的標準硬水、芽胞稀釋液及培養(yǎng)基等亦未被污染，不影響消毒效果的檢測。試驗結(jié)果表明，過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑可有效殺滅枯草桿菌芽胞。

表2　消毒劑最低有效濃度的定量殺滅結(jié)果

表3　消毒劑最短作用時間的定量殺滅結(jié)果

有研究報道[10-12]，含量為20 g/L的戊二醛消毒液對枯草桿菌(芽胞浸泡作用1 h，可將其99.99%殺滅，浸泡4 h，可將其100%殺滅。以0.5 g/L有效氯與1 g/L過氧乙酸復(fù)配得到的復(fù)方消毒劑對枯草芽胞桿菌芽胞懸液作用10 min，對其芽胞載體處理15 min，殺菌率方可達到100%。含量為2 000 mg/L的過氧乙酸消毒劑對枯草芽胞桿菌芽胞作用20 min，可達到合格消毒要求[13-14]。

本研究結(jié)果與上述文獻報道相比，殺滅枯草芽胞桿菌黑色變種芽胞所需有效成分濃度更低，用時更短，殺菌率也得到了提高，一方面降低了消毒成本[15]，另一方面可在短時間達到消毒要求，更適于生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。

[1]古一雯,李臨生,羅琥捷.消毒劑研究新進展[J].中國消毒學(xué)雜志,2008,25(1):70-73.

[2]邱梅,郝智慧,龐云露,等.國內(nèi)外獸用消毒劑的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].中國獸藥雜志,2011,45(6):43-47.

[3]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范(試行)[S].北京:2008：97-103.

[4]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二部[S].北京：2010.

[5]郭亮.復(fù)方消毒劑對細胞的殺滅效果和穩(wěn)定性研究[D].山西太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[6]蘇文雪.復(fù)方消毒劑對病毒的殺滅效果及急性吸入毒性研究[D].山西太谷:山西農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[7]曾宏逵,譚偉龍,錢萬紅,等.過氧乙酸復(fù)方消毒劑殺滅枯草桿菌芽孢的實驗研究[J].東南國防醫(yī)藥,2010,12(2):97-99.

[8]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則[S].北京.

[9]中華人民共和國衛(wèi)生部.消毒技術(shù)規(guī)范[S].北京，2008.

[10]Ivan M,Josef D.Protein-tyrosine phosphorylation inBacillussubtilis:a 10-year retrospective[J].Food Control,2015,6(18):1-7.

[11]Nadine S,Helga N,Maria C,et al.Effectiveness of a peracetic acid-base disinfectant against spores ofBacilluscereusunder different environmental conditions[J].Food Control,2014,39(1):1-7.

[12]豬場消毒藥物的選擇以及具體消毒方案介紹[J].現(xiàn)代畜牧科技,2015,3(1):132.

[13]王慧，周星，蘇丹，等.實驗動物屏障設(shè)施常用消毒方式比較研究[J].醫(yī)學(xué)動物防制,2015,31(2):225-228.

[14]高富紅，李召斌，高艷艷.戊二醛苯扎溴銨溶液對雞傳染性法氏囊病病毒的殺滅效果[J].畜牧與獸醫(yī)，2016,38(1)：62-63.

[15]高富紅，李召斌，高艷艷.戊二醛苯扎溴銨溶液對H9N2亞型禽流感病毒的滅活效果分析[J].中國家禽，2016,38(1)：62-63.

Effect Evaluation of Acetic Acid Peroxide Glutaraldehyde Compound Disinfectant on KillingBacillussubtilisSpores

ZHANG Li,ZHENG Ming-xue,ZHENG Long-long,BAI Rui,DAI Hao-lan,SHI Chen-jie,GONG Xin,XI Rou,SU Xiao-qing,ZHANG Li-qi, HAN Ke-guang,XU Zhi-yong,YANG Sha-sha

(College of Animal Science and Technology,Shanxi Agricultural University,Taigu,Shanxi,030801,China)

In order to evaluate the germicidal effect of acetic acid peroxide disinfectant glutaraldehyde compound,the qualitative germicidal test of suspension and the quantitative bactericidal test suspension of were used toBacillussubtilisblack variant.The results showed that the minimum germicidal concentrationcon of disinfectant to killBacillussubtilisblack variant was 1∶256,and the shortest effect time to killBacillussubtiliswas 5 min.The spores ofBacillussubtilisblack variant could be completely killed at the concentration of 1∶256 in 45 min or at the concentration of 1∶64 in 7.5 min.The results suggested that the disinfectant had strong killing action toBacillussubtilisblack variant spores.It laid a theoretical foundation for the clinical application of the disinfectant.

acetic acid peroxide glutaraldehyde compound disinfectant;Bacillussubtilisblack variant;spore;germicidal effect

2016-02-29

國家科技支撐計劃項目(2007BAD56B06)；山西省研究生創(chuàng)新基金(20143055)；山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目

張黎(1990-)，女，山西呂梁人，博士研究生，主要從事動物傳染病的發(fā)生與免疫機理研究。*通訊作者

S859.799.1;S852.616

A

1007-5038(2016)09-0084-03