丁喜蓮 曲延英 李瓊 郭家雁 陳全家

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

六個海島棉品系體細(xì)胞胚胎發(fā)生及再生體系的研究

丁喜蓮 曲延英 李瓊 郭家雁 陳全家

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

以海島棉D(zhuǎn)J-1（373）、天長2號（376）、5917（380）、阿長-599（381）、塔07-152（383）、S0717（408）6個品系的下胚軸為外植體，通過雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計的方法篩選出的兩組最佳激素組合，誘導(dǎo)出愈傷組織，并成功獲得再生植株。研究結(jié)果表明，0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT 為海島棉380、383和381愈傷組織最佳誘導(dǎo)條件，0.3 mg/L NAA+0.1 mg/L KT 為海島棉373、376和408愈傷組織最佳誘導(dǎo)條件；誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于KNO3加倍的培養(yǎng)基可產(chǎn)生胚性愈傷組織；將其接種于含有0.1 mg/L KT和0.05 mg/L IBA的培養(yǎng)基中可促進(jìn)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生和成熟，利用畸形苗的培育可縮短再生體系的周期，6個品種在6-8個月內(nèi)均能獲得再生植株。

海島棉；激素組合；胚性愈傷

海島棉是纖維品質(zhì)最優(yōu)的栽培棉種，新疆是我國唯一的海島棉商業(yè)化生產(chǎn)基地［1］。組織培養(yǎng)以及以此為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)可充分利用自然界的遺傳資源和加快育種進(jìn)程等優(yōu)勢，為我國棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了一條新的途徑。與其他作物相比，棉花組織培養(yǎng)仍存在體細(xì)胞胚胎發(fā)生率低、培養(yǎng)周期長、畸形胚頻率高等方面的問題［2］，目前的研究主要是針對陸地棉［3］、克勞茨基棉［4］等棉種的再生體系，而海島棉是目前報道可再生棉花品系中較難再生的一種，我國報道的可再生海島棉品系數(shù)量更為有限。

本研究在前人［5-7］的基礎(chǔ)上，以6個新疆主栽海島棉品系為材料，研究激素對誘導(dǎo)愈傷組織和體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力的影響，旨在獲得體細(xì)胞胚胎和再生植株，為拓寬海島棉再生體系基因型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 新疆海島棉品系：DJ-1（373）、天長2號（376）、5917（380）、阿長-599（381）、塔07-152（383）、S0717（408），材料均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點實驗室提供。

1.1.2 基本培養(yǎng)基配方 海島棉再生體系基本培養(yǎng)基配方見表1。培養(yǎng)基各成分均按比例溶解均勻，所用的激素和氨基酸均在滅菌前加入，配置好的培養(yǎng)基用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至5.8-6.0，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。所有培養(yǎng)物均置于培養(yǎng)室（28±2℃，光照強度2 000 Lx，16 h光照）培養(yǎng)。

表1 海島棉愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)基配方表

1.2 方法

1.2.1 無菌苗制備 將不同品系的種子經(jīng)濃硫酸脫絨后，用水沖洗干凈晾干。取適量種子進(jìn)行處理：首先用75%酒精進(jìn)行表面消毒3次，每次30-45 s；然后在30% H2O2中浸泡4-5 h后用無菌水沖洗4-5遍，28℃暗培養(yǎng)箱中無菌水浸泡過夜，直至種子“露白”；在無菌條件下去除種皮，將種仁接種于MS0培養(yǎng)基中促使種子萌發(fā)，（28±2）℃暗培養(yǎng)3 d后放于培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，獲得6 d齡無菌苗備用。1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)和增殖 取下胚軸中間段，棄去靠近子葉呈綠色及靠近胚根呈白色部位，將下胚軸切成0.5-0.8 cm小段，每6個小段接分別種于含30 mL左右的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS1和MS2中，每20-25 d于新鮮培養(yǎng)基繼代1-2次。30 d時統(tǒng)計各棉花品系出愈率：

1.2.3 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖 待下胚軸與愈傷組織產(chǎn)生較明顯的隔離層以后，去除下胚軸，將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基MS3，每12-18 d于新鮮培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)一次。該階段在愈傷組織塊邊緣可分化出胚性愈傷組織，稱為“初生性胚性愈傷組織”，為6個海島棉品系的分化階段建立一個“剝離胚性愈傷”的優(yōu)化處理階段。處理A1：在MS4培養(yǎng)基上，將已成功獲得再生品系的胚性愈傷與之放于同一培養(yǎng)瓶中。處理A2：將初生性胚性愈傷組織剝離接種于MS5培養(yǎng)基上，降低NH4+/NO3

-比例促進(jìn)體胚發(fā)生。30 d后，觀察統(tǒng)計各棉花品系的胚性愈傷組織情況。每個培養(yǎng)基中的最初接種量為0.2 g左右，每個處理均為50瓶，計算胚性愈傷組織出愈率：

1.2.4 不同海島棉品系胚性愈傷組織細(xì)胞學(xué)觀察 挑選繼代培養(yǎng)3次后的胚性愈傷組織，參照代鑫［10］的方法做石蠟切片，在Olympus顯微鏡下觀察并照相。

1.2.5 體細(xì)胞胚胎的獲得 將增殖后的淡黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基MS5（鋪墊無菌濾紙）上，并設(shè)置不同濃度的激素組合，CK為對照組，C1為MS5+0.1 mg/L KT+0.1 mg/L 2，4-D，C2為MS5+0.1 mg/L KT+0.05 mg/L IBA，每25-28 d繼代一次，繼代培養(yǎng)3次后，統(tǒng)計體細(xì)胞胚胎發(fā)生數(shù)和子葉胚發(fā)生率。

1.2.6 體細(xì)胞胚胎的成熟及植株再生 將未成苗的體細(xì)胞胚胎每12-15 d繼代培養(yǎng)一次，每次繼代時將不同時期的體細(xì)胞胚胎分開培養(yǎng)，直至獲得完整子葉胚，將其接種到MS6培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得完整植株。

2 結(jié)果

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)和生長

外植體接種到MS1和MS2之后，4-6 d左右兩端切口開始膨大，開始形成愈傷組織；30 d后可觀察到大量的愈傷組織。本研究所用的2 種激素組合均可以誘導(dǎo)形成愈傷組織，在前期的預(yù)實驗中，采用雙因素區(qū)組設(shè)計的方法分別篩選出KT/2，4-D與KT/NAA的最適濃度，結(jié)果表明0.1 mg/L 2，4-D+0.1mg/L KT 激素組合和0.3 mg/L NAA+0.1 mg/L KT激素組合誘導(dǎo)愈傷組織的效果最佳。愈傷組織誘導(dǎo)率在6個品系之間有所差異，變幅為 22%-95%（表2）。同一個品系在不同的激素組合處理下，誘導(dǎo)出的愈傷組織狀態(tài)和誘導(dǎo)率也有很大差異，通過實驗結(jié)果分析，KT+2，4-D的激素組合處理下，愈傷組織多為黃色或黃綠色，海島棉品系380、381和383出愈率較高，分別為91%、89%和92%，且狀態(tài)較好；KT+NAA的激素組合處理下，海島棉品系373、376和408出愈率較高，分別為95%、87%和92%，外植體上有數(shù)量不等的不定根形成。

表2 不同激素組合下6個棉花品系愈傷組織誘導(dǎo)情況

2.2 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖

由圖1可知，A1處理下，6個品系在20-25 d左右即可誘導(dǎo)出新的胚性愈傷組織，且出愈率分別為42%、24%、58%、34%、74%和78%；而A2處理下，在40 d左右才能觀察到極少量的胚性愈傷組織，且誘導(dǎo)率0%、1%、4%、2%、6%和2%。因此，將新挑出的初生性胚性愈傷組織接種到MS4培養(yǎng)基，并在同一個培養(yǎng)瓶中放入已獲得的其他品系的胚性愈傷，可大大提高此棉花品系出現(xiàn)胚性愈傷的速度和可能性，且此方法適用于本實驗的6個不同基因型的海島棉品系；因此可以推斷出：通過胚性愈傷組織次生代謝物的影響，可以加快初生性胚性愈傷組織向胚性愈傷組織分化的進(jìn)程。

圖 1 各海島棉品系愈傷處理情況

2.3 不同海島棉品系胚性愈傷組織細(xì)胞學(xué)觀察

由圖2可以看出，胚性愈傷組織由胚性細(xì)胞和非胚性細(xì)胞組成，胚性細(xì)胞邊緣清晰完整，與周圍的非胚性細(xì)胞有明顯的界限，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞質(zhì)濃厚，染色清晰，胚性細(xì)胞有的位于愈傷組織內(nèi)部，有的位于邊緣，它處于增殖旺盛和分化的狀態(tài)，有胚胎發(fā)生能力；周圍未分化的非胚性細(xì)胞排列疏松，大而不規(guī)則，只能看清細(xì)胞壁，看不到明顯的細(xì)胞核，細(xì)胞液泡化程度高，細(xì)胞質(zhì)少而染色淺，細(xì)胞間的空隙較大，這類細(xì)胞雖具有增殖能力，但沒有胚胎發(fā)育能力。而且，胚性愈傷中的胚性細(xì)胞和非胚性細(xì)胞差別較大，容易辨別。而不同基因型的海島棉胚性愈傷組織細(xì)胞學(xué)之間并無明顯差異。

2.4 體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)和成熟

以不加激素的MS5培養(yǎng)基為對照，進(jìn)行了不同激素組合對體細(xì)胞胚胎發(fā)生影響的研究。表3顯示，不加激素的情況下，總胚發(fā)生數(shù)較少，子葉胚發(fā)生率很低，最高為7.14%，C2處理下，總胚發(fā)生數(shù)和子葉胚發(fā)生率均有明顯提高，6個棉花品系子葉胚發(fā)生率分別為14.29%、21.33%、15.25%、16.00%、18.87%和14.46%。說明對于不同基因型的海島棉品系，添加激素均有利于誘導(dǎo)海島棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生，KT+2，4-D激素組合處理下，雖也能促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，但效果不太明顯，而KT+IBA激素組合則能顯著提高子葉胚發(fā)生率，縮短胚性愈傷分化為體細(xì)胞胚胎的時間，有效地縮短了海島棉再生體系的周期。

圖2 六個海島棉品系胚性愈傷組織細(xì)胞學(xué)觀察

2.5 畸形苗的培育對海島棉再生體系周期的影響

誘導(dǎo)出的體胚中有畸形苗的發(fā)生率非常高（80%以上），將畸形苗轉(zhuǎn)入MS6培養(yǎng)基，一般30 d左右就會褐化死亡，將死亡的畸形苗放置在MS6培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，會發(fā)現(xiàn)畸形苗的根部附近會生長出大量胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚胎（圖3-B），將所得胚性愈傷及體細(xì)胞胚再次放入MS5培養(yǎng)基后所得到的胚性愈傷再生能力強且畸形率僅為37%左右，使棉花再生體系培養(yǎng)周期縮短3-4個月［7］。這一現(xiàn)象的出現(xiàn)為縮短棉花再生體系周期提供了新的途徑。

表3 不同激素組合下6個棉花品系體細(xì)胞胚胎發(fā)生率

圖3 畸形苗的培育過程

3 討論

誘導(dǎo)愈傷組織是棉花組織培養(yǎng)的起始階段，能否獲得活力旺盛且易分化的愈傷組織是獲得棉花再生植株的前提。棉花愈傷組織誘導(dǎo)的激素主要有KT、ZT、2，4-D、NAA和IBA等，生長素與細(xì)胞分裂素的合理結(jié)合可促使?fàn)顟B(tài)較好愈傷組織的誘導(dǎo)［3］。本研究表明不同濃度的2，4-D/KT和NAA/KT兩種激素組合均可使海島棉誘導(dǎo)出愈傷組織。在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入0.1 mg/L 2，4-D和0.1 mg/L KT，愈傷多為淡黃色，增殖速度較，是海島棉380、383和381愈傷組織最佳誘導(dǎo)條件；在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中0.3 mg/L NAA和0.1 mg/L KT，愈傷多為淡綠色，增殖速度較慢，易長出不定根，而不定根附近較易誘導(dǎo)出胚性愈傷，是373、376和408愈傷組織最佳誘導(dǎo)條件。有研究表明380、381和383親緣關(guān)系較為接近［11］，因此，針對不同基因型的棉花品系，應(yīng)設(shè)計不同的激素組合及配比，親緣關(guān)系較近的品系可采用相同或相似的激素組合。

圖4 海島棉的愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生

在海島棉再生體系中，海島棉胚性愈傷組織的挑選和繼代培養(yǎng)是非常關(guān)鍵的一個階段。本研究通過胚性愈傷組織次生代謝物的影響，將新挑出的初生性胚性愈傷組織與已獲得的其他品系的胚性愈傷接種到同一個培養(yǎng)瓶中，以此提高此棉花品系出現(xiàn)胚性愈傷的速度，此方法可適用于所有海島棉品系，提高胚性愈傷發(fā)生率，有利于縮短海島棉再生體系周期。

胚性愈傷組織細(xì)胞學(xué)觀察中，胚性細(xì)胞與非胚性細(xì)胞在形態(tài)上差別很大，胚性細(xì)胞之間結(jié)合緊密，且多分布在細(xì)胞邊緣，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，有明顯的核仁結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁也較厚，細(xì)胞間在生理上出現(xiàn)相對隔離。可依此推測，在胚性細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)育過程中處于相對獨立狀態(tài)，有利于形成成熟的體細(xì)胞胚及其進(jìn)一步的發(fā)育［12］。

體細(xì)胞胚胎發(fā)生是棉花組織培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，氮源和激素是影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生和成熟的重要因素［13-15］，增加 KNO3的濃度能促進(jìn)體細(xì)胞胚的發(fā)生［16］。張寶紅等［17］研究發(fā)現(xiàn)IBA、ABA、IAA、BA、KT、ZT和ZiP對棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有促進(jìn)作用，IBA+KT組合通常用來繼代培養(yǎng)胚性愈傷組織和促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生［18］。本研究中將淡黃色、顆粒狀的胚性愈傷轉(zhuǎn)入KNO3加倍，去除NH4NO3并鋪墊無菌濾紙，添加KT和IBA的MS5培養(yǎng)基中，5-7個月即可成功誘導(dǎo)出6個海島棉品系的體細(xì)胞胚胎。

畸形苗的發(fā)生是植物組織培養(yǎng)中一種常見的生理異?，F(xiàn)象，嚴(yán)重制約著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展?；蚊绲漠a(chǎn)生與形成是多因素共同作用的結(jié)果［19］，很難從根本上解決這一問題，但是可以將這些畸形苗加以合理的利用，使畸形胚轉(zhuǎn)化為正常苗。本實驗通過對畸形苗的培育研究，探索出了一條由畸形苗直接獲得體胚的捷徑。

棉花體細(xì)胞再生技術(shù)已經(jīng)較為完善，但當(dāng)前的海島棉再生體系還不能完全克服海島棉基因型限制。因此，優(yōu)化海島棉再生體系是一項值得探索的工作?；蛐蛯γ藁w細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的限制只是相對而言的，關(guān)鍵在于能否根據(jù)供試材料的遺傳背景采取與之相適應(yīng)的培養(yǎng)手段和措施。相對而言，陸地棉的再生體系較為簡單，誘導(dǎo)愈傷組織所用的濃度較低［20］，體細(xì)胞胚胎的分化速度較快且分化率較高［21］。本研究以下胚軸為外植體，對海島棉的再生體系進(jìn)行優(yōu)化研究，獲得了6個海島棉品系的再生植株，擴(kuò)展了海島棉再生基因型，為促進(jìn)新疆海島棉轉(zhuǎn)基因研究具有一定的意義。

4 結(jié)論

本研究以下胚軸為外植體材料，成功建立了6個海島棉品系的再生體系，在6-8個月均獲得了再生植株。在愈傷組織誘導(dǎo)階段，在培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L 2，4-D和0.1 mg/L KT 時，海島棉380、383和381愈傷組織誘導(dǎo)效果最好，而添加0.3 mg/L NAA和0.1 mg/L KT 則為海島棉373、376和408愈傷組織最佳誘導(dǎo)條件；在胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段，利用成熟的胚性愈傷組織產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物可加快胚性愈傷組織的分化；在體細(xì)胞胚胎分化階段，在培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L KT和0.05 mg/L IBA可促進(jìn)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生和成熟，而且利用畸形苗的培育可縮短再生體系的周期。

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（責(zé)任編輯馬鑫）

The Study of Regeneration System from Different Sea Island Cotton（Gossypium barbadense L.）Cultivars

DING Xi-lian QU Yan-ying LI Qiong GUO Jia-yan CHEN Quan-jia
（College of Agriculture，Xinjiang University，Urumqi 830052）

The hypocotyls of 6 sea island cotton cultivars， i. e. ， DJ-1（373）， Tianchang 2（376）， 5917（380）， Achang-599（381），Ta 07-152（383）， and S0717（408）were used as explant materials；calli were successfully induced with two optimized combinations of plant growth regulator（PGR）screened by the method of double factors randomized block， and the plants were regenerated successfully. The results showed that， the best PGR combination to induce callus for 380， 383， and 381 was 0.1 mg/L 2， 4-D + 0.1 mg/L KT， while that for 373，376， and 408 was 0.3 mg/L NAA + 0.1 mg/L KT. The induced calli inoculated into the medium of double KNO3generated embryogenic ones， and inoculating them into the medium of 0.1 mg/L KT and 0.05 mg/L IBA promoted the somatic embryogenesis and their maturing. The culture of malformed seedlings shortened the cycle of regeneration system， and the regenerated plants were all obtained from 6 cultivars in 6 to 8 months. A stable and efficient regeneration system without genotype limit was established.

sea island cotton；plant growth regulator；embryogenic callus

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.016

2015-03-09

國家轉(zhuǎn)基因生物新品培育重大專項（2013ZX08005-004，2013ZX08005-005）

丁喜蓮，女，碩士研究生，研究方向：棉花基因工程；E-mail：dxh620@163.com

陳全家，男，教授，研究方向：作物遺傳育；E-mail：chqjia@126.com