王法微董金曄李曉薇劉洋吳學(xué)彥王南董園園陳歡李海燕，

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長(zhǎng)春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

山葡萄CBF基因表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)擬南芥根生長(zhǎng)的影響

王法微1董金曄2李曉薇1劉洋2吳學(xué)彥2王南1董園園1陳歡2李海燕1，2

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長(zhǎng)春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

為了研究山葡萄CBF基因調(diào)節(jié)植物對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答機(jī)理，分別構(gòu)建了山葡萄VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3的植物過表達(dá)載體。經(jīng)酶切及瓊脂糖電泳檢測(cè)證實(shí)3個(gè)基因均插入到pBASTA中，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。然后，分別將3個(gè)植物過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，并通過浸花法浸染擬南芥。利用除草劑篩選獲得3個(gè)基因的擬南芥過表達(dá)株系。最后，對(duì)野生型擬南芥與轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)OE-CBF2轉(zhuǎn)基因植株的主根伸長(zhǎng)長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于其它植株，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的側(cè)根長(zhǎng)度也明顯長(zhǎng)于野生型植株。上述結(jié)果表明山葡萄CBF基因可能在植物鹽脅迫中對(duì)根部生長(zhǎng)發(fā)育起到非常重要的調(diào)控作用。

山葡萄；CBF基因；表達(dá)載體；根生長(zhǎng)

Boyer等［1］指出環(huán)境問題將成為影響作物產(chǎn)量的一個(gè)重要因素。雖然無(wú)法精確計(jì)算出環(huán)境因素對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量影響的具體數(shù)值，但可耕地面積的逐漸減少勢(shì)必導(dǎo)致糧食作物產(chǎn)量的持續(xù)下滑［2，3］。2007年，世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)出目前全球只有3.5%的土地未受到環(huán)境因素影響［4］。這為人們敲響了警鐘，在不久的將來(lái)糧食問題可能又會(huì)成為社會(huì)亟待解決的主要問題。為了降低環(huán)境因素對(duì)糧食產(chǎn)量的影響，選育抗逆性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)作物新品種已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)科研工作者的主要目標(biāo)。農(nóng)作物新品種選育的方法主要為傳統(tǒng)遺傳育種與基因工程育種。由于基因工程育種具有目的性強(qiáng)，育種周期短，可克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙等優(yōu)點(diǎn)，該方法已經(jīng)成為育種的主要手段。而基因工程育種所需要的表達(dá)調(diào)控元件以及抗逆基因的挖掘成為重中之重。

CBF（C-repeat binding factor，CBF）轉(zhuǎn)錄因子是AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)亞家族，它是植物調(diào)節(jié)逆境脅迫的重要轉(zhuǎn)錄因子之一［5］。CBF能夠與啟動(dòng)子中一個(gè)5 bp大小的核心片段（CCGAC）相結(jié)合，從而調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄水平［6，7］。CBF基因的表達(dá)能夠被多種非生物脅迫以及上游轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控［8-10］。目前，多種植物CBF轉(zhuǎn)錄因子參與逆境脅迫的分子機(jī)制已經(jīng)被揭示，包括擬南芥［11］、水稻［12］、玉米［13，14］、小麥［15，16］、大豆［17，18］和葡萄［19］等。擬南芥4個(gè)CBF基因過表達(dá)后均能夠激活下游靶基因的表達(dá)，并能夠提高植物的抗寒能力［20］。AtCBF2基因的負(fù)調(diào)控作用能夠?qū)tCBF1及AtCBF3起到適當(dāng)調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)強(qiáng)度，從而適度的調(diào)節(jié)植物對(duì)低溫以及相關(guān)脅迫的應(yīng)答［21］。目前，擬南芥CBF基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)路已經(jīng)十分清楚，大麥與番茄等植物CBF基因在耐鹽等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用機(jī)制也得到了初步證實(shí)［22，23］。這些研究成果均說(shuō)明CBF轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物耐寒、耐鹽等非生物脅迫過程中起著重要的調(diào)控作用。

本研究以野生山葡萄為材料，在已經(jīng)成功分離了山葡萄VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3的基礎(chǔ)上［24］，分別將3個(gè)基因構(gòu)建到植物過表達(dá)載體中，利用浸花法將目的基因轉(zhuǎn)入擬南芥基因組中，并對(duì)野生型擬南芥與轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行鹽脅迫處理，以探究其在植物鹽脅迫中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用轉(zhuǎn)基因植物材料為哥倫比亞野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana col-0）。山葡萄VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3基因（GenBank登錄號(hào)：DQ51-7296、DQ517297和DQ517298）由本實(shí)驗(yàn)室克隆。農(nóng)桿菌EHA105和植物表達(dá)載體pBASTA由本實(shí)驗(yàn)室保存。克隆載體pMD18-T，限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Ex Taq聚合酶均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司。PCR引物（表1）及基因測(cè)序均由北京金唯智生物科技有限公司完成。

表1 山葡萄CBF基因表達(dá)載體構(gòu)建所用引物

1.2 方法

1.2.1 山葡萄CBF基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建 分別以VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3的克隆載體質(zhì)粒為模板，利用基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將3個(gè)PCR產(chǎn)物分別與表達(dá)載體pBASTA同時(shí)使用EcoR I與Xba I進(jìn)行雙酶切，回收目的基因與載體大片段后，利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。提取陽(yáng)性菌液質(zhì)粒DNA并進(jìn)行酶切鑒定，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別命名為pB-CBF1、pB-CBF2和 pB-CBF3。將3個(gè)重組質(zhì)粒送交北京金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 表達(dá)載體向農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化 將農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞置于冰上緩慢融化，將重組質(zhì)粒pB-CBF1、pB-CBF2和 pB-CBF3分別加入感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min。將離心管放置在液氮中冷凍1 min，然后在37℃水浴中溫育5 min。溫育過后，每個(gè)離心管中分別加入1 mL無(wú)抗生素的YEP培養(yǎng)基，在28℃搖床中振蕩培養(yǎng)2-4 h。將菌液離心濃縮后涂于含有50 mg/L卡那霉素和100 mg/L利福平的固體YEP培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2-3 d，挑取單菌落后進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥 將野生型擬南芥播種于培養(yǎng)缽中，待擬南芥長(zhǎng)至抽薹初期時(shí)剪掉所有擬南芥的主莖。當(dāng)周圍的莖抽薹后除去已經(jīng)開的花準(zhǔn)備浸染。同時(shí)準(zhǔn)備農(nóng)桿菌菌液，將農(nóng)桿菌離心沉淀后使用滲透緩沖液（5%蔗糖，0.02% SilwettL-77）將菌液OD600調(diào)至0.9-1.0。將擬南芥花序部分倒置于滲透緩沖液中浸泡1-3 min，之后使用保鮮膜密封后黑暗下平放24 h，最后置于培養(yǎng)室中正常培養(yǎng)。待種子成熟時(shí)收取種子，以備后續(xù)鑒定。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選與單拷貝株系鑒定 將4℃春化2 d后的T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子播種于培養(yǎng)缽中，待長(zhǎng)至四葉期時(shí)噴施1% Basta，每隔1 d噴施1次，共計(jì)噴施3次。觀察擬南芥幼苗生長(zhǎng)情況，始終保持綠色的為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，慢慢枯萎死亡的為非轉(zhuǎn)基因植株。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株移栽至無(wú)Basta的培養(yǎng)缽中繼續(xù)培養(yǎng)，并收獲T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。將T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子播種于含有1% Basta的MS固體培養(yǎng)基中，每個(gè)株系播種約100棵。統(tǒng)計(jì)各株系死亡率后計(jì)算各個(gè)轉(zhuǎn)基因株系是否符合孟德爾遺傳規(guī)律的分離比，從而鑒定單拷貝株系。將單拷貝株系移栽后收取T2代擬南芥種子，準(zhǔn)備用于根系的生長(zhǎng)發(fā)育實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的根系發(fā)育分析 將WT與VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3的T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子春化處理2 d，經(jīng)70%酒精消毒30 min后，點(diǎn)播于MS固體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)7 d后，分別將各個(gè)株系植株移栽至含有150 mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行鹽脅迫處理。處理7 d后觀察各株系表型變化，并分別統(tǒng)計(jì)主根伸長(zhǎng)長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)以及側(cè)根長(zhǎng)度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，并利用SPSS軟件分析各組數(shù)據(jù)差異的顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 山葡萄CBF基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

提取表達(dá)載體pB-CBF1、pB-CBF2和 pB-CBF3的質(zhì)粒DNA，利用EcoR I與Xba I進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果（圖1）顯示3個(gè)質(zhì)粒各切出一條約756 bp、762 bp與720 bp的特異條帶。這證實(shí)山葡萄VaCBF1、VaCBF2和VaCBF1基因已經(jīng)成功插入到表達(dá)載體中。將pB-CBF1、pB-CBF2和 pB-CBF3的質(zhì)粒DNA測(cè)序后證實(shí)，載體插入片段與目的基因序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)有堿基突變。

2.2 表達(dá)載體向農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化

分別挑取轉(zhuǎn)化后YEP平板上的單菌落，接種于5 mL液體YEP培養(yǎng)基中搖菌。待菌液生長(zhǎng)至OD600為0.8左右時(shí)各取1 mL菌液作為模板，利用基因特異性引物（表1）進(jìn)行PCR驗(yàn)證陽(yáng)性菌落。PCR結(jié)果（圖2）顯示，3種農(nóng)桿菌中均含有轉(zhuǎn)化的目的基因，證實(shí)VaCBF1、VaCBF2和VaCBF1基因分別成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

圖1 表達(dá)載體酶切驗(yàn)證

圖2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選及單拷貝株系鑒定

待T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)至四葉期時(shí)利用Basta篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，噴施3次Basta后非轉(zhuǎn)基因植株死亡，而轉(zhuǎn)基因植株仍可以繼續(xù)生長(zhǎng)（圖3-A）。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株移栽至正常土壤的營(yíng)養(yǎng)缽中繼續(xù)生長(zhǎng)，并收取該株系T1代種子。將T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行春化后播種于含有1% Basta的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行再次篩選，并計(jì)算轉(zhuǎn)基因植株死亡率（圖3-B）。OE-CBF1、OE-CBF2和OE-CBF3三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的分離比分別為3.26∶1、3.51∶1與2.88∶1，基本符合孟德爾遺傳定律，證實(shí)3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系為單拷貝株系。

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥主根生長(zhǎng)發(fā)育分析

將WT與3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系T2代種子播種于MS固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，待生長(zhǎng)至7 d時(shí)測(cè)量各個(gè)株系的主根長(zhǎng)度。結(jié)果（圖4）顯示，WT與OE-CBF1的主根長(zhǎng)度相一致，而OE-CBF2與OE-CBF3的主根長(zhǎng)度要顯著短于WT及OE-CBF1。這說(shuō)明在正常生長(zhǎng)情況下，VaCBF2及VaCBF3的過表達(dá)在一定程度上對(duì)擬南芥主根生長(zhǎng)造成了抑制。

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南鹽脅迫下的根系發(fā)育分析

將WT與3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系T2代種子播種于MS固體培養(yǎng)基中，待生長(zhǎng)至7 d后移栽至含有150mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行鹽脅迫處理。脅迫處理8 d后觀察各個(gè)株系根系的生長(zhǎng)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)OE-CBF2株系的主根長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于其他3個(gè)株系（圖5）。而OE-CBF2在正常生長(zhǎng)情況下的主根長(zhǎng)度卻顯著短于WT植株（圖4），產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是在鹽脅迫下VaCBF2轉(zhuǎn)錄因子基因能夠激活一系列鹽應(yīng)答基因的表達(dá)，增強(qiáng)了植物對(duì)鹽脅迫的抵抗能力，從而降低了鹽脅迫對(duì)主根生長(zhǎng)的影響。

圖3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選（A）及單拷貝株系鑒定（B）

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥主根生長(zhǎng)狀態(tài)分析

圖5 鹽脅迫下擬南芥表型（A）及主根伸長(zhǎng)分析（B）

另外，在鹽脅迫后，OE-CBF1的側(cè)根數(shù)量顯著多于其他3個(gè)株系（圖6-A）。這說(shuō)明在鹽脅迫條件下VaCBF1可能對(duì)植物側(cè)根數(shù)起著一定的調(diào)控作用。同時(shí)，OE-CBF1、OE-CBF2和OE-CBF3三個(gè)株系的側(cè)根長(zhǎng)度均顯著長(zhǎng)于WT（圖6-B）。這說(shuō)明VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3在鹽脅迫中對(duì)植物側(cè)根的伸長(zhǎng)均起著重要調(diào)控作用。

3 討論

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，逐漸形成了自身對(duì)環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，當(dāng)植物受到外界刺激后能夠通過植物細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)變化來(lái)實(shí)現(xiàn)和調(diào)節(jié)脅迫應(yīng)答反應(yīng)。1997年，Stockinger等［6］在擬南芥中首先發(fā)現(xiàn)一個(gè)能夠與C重復(fù)序列相結(jié)合的因子，即CBF轉(zhuǎn)錄因子，并且命名為AtCBF1。在正常生長(zhǎng)條件下，擬南芥3個(gè)CBF基因的過表達(dá)植株均表現(xiàn)出生長(zhǎng)延遲的現(xiàn)象［11］。將玉米ZmCBF3基因轉(zhuǎn)入水稻中進(jìn)行過表達(dá)，在正常生長(zhǎng)條件下也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)情況受到了一定程度的抑制［25］。而本研究結(jié)果顯示OE-CBF2與OE-CBF3在正常生長(zhǎng)條件下的主根長(zhǎng)度均小于野生型植株。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是由于轉(zhuǎn)錄因子可直接調(diào)控多個(gè)下游靶基因，從而導(dǎo)致多個(gè)基因的過表達(dá)。這種多基因過表達(dá)可能會(huì)增加植物內(nèi)能源消耗，最終導(dǎo)致植物根系生長(zhǎng)發(fā)育的延遲。

圖6 鹽脅迫下WT與轉(zhuǎn)基因擬南芥?zhèn)雀L(zhǎng)狀態(tài)分析

當(dāng)植物處于非正常生長(zhǎng)條件時(shí)，植物受到脅迫刺激后CBF基因的過表達(dá)就會(huì)調(diào)節(jié)下游相關(guān)基因的表達(dá)從而抵御外界環(huán)境的刺激［23，26］。CBF調(diào)控的下游靶基因主要有COR15A、RD29A與KIN2等與逆境脅迫密切相關(guān)基因，這些靶基因直接調(diào)控植物對(duì)不同逆境脅迫的應(yīng)答。在干旱及低溫處理?xiàng)l件下，擬南芥CBF基因過表達(dá)植株生存率明顯高于野生型對(duì)照［11］。在干旱脅迫下，水稻ZmCBF3的過表達(dá)株系也表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐旱能力［25］。本研究中將轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行鹽脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OE-CBF2的主根伸長(zhǎng)長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于其他植株。而番茄屬的兩個(gè)CBF基因（SlCBF1與ShCBF1）在擬南芥中過表達(dá)后，在鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株的根系生長(zhǎng)發(fā)育明顯優(yōu)于WT［23，26］。Duan等［27］報(bào)道，在鹽脅迫下植物側(cè)根的生長(zhǎng)處于停滯狀態(tài)，直到生長(zhǎng)條件恢復(fù)正常后才能開始繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育。而本研究中在鹽處理后OE-CBF1的側(cè)根數(shù)量明顯多于WT，而且OE-CBF1、OE-CBF2和 OE-CBF3的側(cè)根長(zhǎng)度均顯著長(zhǎng)于WT，表明VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3的過表達(dá)在一定程度上緩解了鹽脅迫對(duì)植物根系生長(zhǎng)發(fā)育的抑制作用。說(shuō)明山葡萄CBF基因可能通過調(diào)節(jié)植物根系發(fā)育來(lái)調(diào)節(jié)植物對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答。但本研究只局限于植物根部發(fā)育的變化，該基因調(diào)控植物根系發(fā)育的分子機(jī)制仍不清楚，還有待于進(jìn)一步的研究來(lái)揭示。

4 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建山葡萄VaCBF1、VaCBF2及VaCBF3基因的植物過表達(dá)載體，并分別將3個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，獲得3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系OE-CBF1、OE-CBF2與OE-CBF3。對(duì)野生型擬南芥與轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)OE-CBF2轉(zhuǎn)基因植株的主根伸長(zhǎng)長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于其它植株，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的側(cè)根長(zhǎng)度也明顯長(zhǎng)于野生型植株。

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（責(zé)任編輯馬鑫）

The Construction of Expression Vector of Gene CBF from Vitis amurensis and the Effects of It on the Root Growth of Arabidopsis

WANG Fa-wei1DONG Jin-ye2LI Xiao-wei1LIU Yang2WU Xue-yan2WANG Nan1DONG Yuan-yuan1CHEN Huan2LI Hai-yan1，2
（1. Ministry of Education Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development，Jilin Agricultural University，Changchun 130118；2. College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118）

In order to investigate the response mechanism of CBF gene in the regulation of plant to the salt stress， the plant overexpression vectors of VaCBF1， VaCBF2 and VaCBF3 from Vitis amurensis were constructed. The results by restriction enzyme digestion and agarose gel electrophoresis showed that 3 genes were correctly inserted into pBASTA， indicating that the expression vectors were successfully constructed. Then， 3 over-expressed vectors were transformed into Agrobacterimu tumefaciens EHA105， and Arabidopsis thaliana was leached using floral dip method. The transgenic plants of A. thaliana with over-expression of 3 genes were screened by herbicide Basta. Furthermore， wild and transgenic plants were treated with salt stress. The results revealed that the elongation length of primary root of OE-CBF2 transgenic plant was longer than others， and the lateral roots in 3 genes transgenic plants were longer than wild ones. These results indicate that the CBF genes of V. amurensis play the critical regulation role in the root development during salt stress.

Vitis amurensis；CBF gene；expression vector；root growth

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.019

2015-02-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201144，31271746），吉林省發(fā)改委項(xiàng)目（JF2012C002-04），吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410193036）

王法微，男，助理研究員，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：fw-1980@163.com

李海燕，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：hyli99@163.com